仪器信息网APP

选仪器、听讲座、看资讯

立即体验

当前位置：仪器社区 >基础知识专区 > 分析化学 > 帖子详情

【资料】大球盖菇过氧化物酶及超氧化物歧化酶的研究

面对面想你

2009/03/26

大球盖菇过氧化物酶及超氧化物歧化酶的研究

张琪林1,王红2

(1·运城学院生命科学系,山西运城044000;2·运城学院生化实验中心,山西运城044000) 摘　要:采用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳法测定大球盖菇过氧化物酶和超氧化物歧化酶(SOD)同工酶活性,结果表明大球盖菇过氧化物酶有4种同工酶,比移分别是:0.13、0.18、0.25、0.32,其活性大小接近. SOD三种都有,比移分别为0.20、0.21、0.25,以Cu·Zn-SOD活性最大,Mn-SOD活性较小.Cu·Zn-SOD 及Mn-SOD辅因子易于丢失,应用时应予以注意.

关键词:大球盖菇;过氧化物酶;超氧化物歧化酶;聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳

中图分类号:Q935　文献标识码:A

大球盖菇(Strophariarugoso-annulate)栽培广泛,食药两用,深受菇农与消费者青睐,栽培研究颇多,生理研究也日渐深入.已有液体培养氮碳营养源[1]、与pH关系[2]、胞外酶特性[3]等研究报道,而胞内酶研究报道尚未见到.过氧化物酶、超氧化物歧化酶是机体清除H2O2、超氧离子(O-2)等活性氧的氧化还原酶.

对生物抗氧化、防辐射、抗衰老等方面都有重要作用,尤其是SOD.本文采用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电用方法鉴定大球盖菇上述两种酶的活性及种类,以期为大球盖菇的生理生化研究和大球盖菇的应用提供理论依据.

1　材料与方法

1.1　材料

供试菌株引自河南省清丰县食用菌技术推广中心.所用化学试剂均为分析纯.

1.2　方法

1.2.1　菌丝培养　20%土豆浸汁1000mL,蔗糖 20g,蛋白胨2g,磷酸二氢钾2g,硫酸镁1.5g,pH值自然.分装于300mL锥形瓶,每瓶50mL,高压灭菌.接种后25~28℃恒温摇床培养21天,振荡频率为120r/min.

1.2.2　酶液制备　菌丝冲洗干净后,于-4℃冷冻 12h.按菌丝∶0.1MpH7.4磷酸缓冲液(冷藏)∶石英砂=1∶2∶0.2比例混合.冰浴磨成匀浆.在 10℃以下环境离心(4000r/min,15min).取上清液 5份与40%蔗糖(冷藏)、0.01%溴酚蓝各1份混合,置冰箱备用.

1.2.3　电泳　方法为聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳. 样品分离胶浓度为7%,pH8.9.浓缩胶浓度为2. 5%,pH6.7.电极缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液, pH8.3.点样量为30μL/管.以溴酚蓝为指示剂.电流开始为10mA,电泳两分钟后加大至50mA.待溴酚蓝移至凝胶柱下端附近时停止电泳.电泳环境温度为10℃,时间1.2h.

1.2.4　染色

1.2.4.1　过氧化物酶染色　A液:0.4g联苯胺加入3mL冰醋酸于80℃溶解,加入17mL蒸馏水,随用随配.B液:4%氯化铵.C液:5%EDTA.D液:0. 3%H2O2.按等体积加8倍水混合,量以淹没胶柱为度.剥胶后立即放入染液,等到有蓝色谱带出现后,取出用水冲洗干净,再用7%醋酸脱色漂洗后观察.

1.2.4.2　SOD染色　(1)对照a、在2.45×10-2M 氯化硝基四氮唑蓝(NBT)液中黑暗下浸泡1h,温度37℃.b、在2.8×10-2M四甲基乙二胺、2.8× 10-5M核黄素和在3.6×10-2MpH7.8磷酸缓冲液中黑暗下浸泡1h,温度37℃.c、在1×10-4M EDTA,5×10-2MpH7.8磷酸缓冲液中,距40W日光灯20cm光照20min.(2)添加辅基处理.在(1 中分别添加5mMNa2SO4;FeSO4;MnSO4;CuSO4+ ZnSO4;FeSO4+MnSO4+CuSO4+ZnSO4.(3)添加抑制剂处理.在酶液中分别添加10mMKCN或 30%氯仿-乙醇,其他同上.

2　结果与讨论

2.1　过氧化物酶谱及分析

结果如图1.从图1可见,大球盖菇菌丝体过氧化物酶有4条带.比移分别为0.13,0.18,0.25, 0.32.其活性大小接近.

2.2　超氧化物歧化酶谱及分析

(1)添加SOD辅因子试验结果见图2.从中可见共有三条带.比移分别为A:0.20,B:0.21,C:0. 25.都有B带,但加铁处理(3、6)的较亮,说明B带是Fe-SOD,铁离子对该SOD活性有明显的增强作用.没有加铁的处理(1,2,4,5)SOD也有活性,说明铁与酶蛋白的结合较牢固,不易丢失.1,2,3,5 无A带,4,6有,说明A带是Mn-SOD.同理,C带为 Cu·Zn-SOD.未加锰、铜、锌盐的没有相应的带,说明锰、铜、锌与酶蛋白的结合较为松散,易于丢失. 比较三种SOD,以Mn-SOD活力最小,Cu·Zn-SOD 活性最大.

(2)添加抑制剂试验结果为:加KCN后,显色结果无C带;加氯仿-乙醇后,无A带.已知10mM KCN抑制Cu·Zn-SOD,30%氯仿-乙醇抑制Mn- SOD[4].说明2.2.1结论是正确的.

综上所述,大球盖菇菌丝体抗氧化酶比较丰富,过氧化物同工酶有4种;超氧化物歧化酶有3 种,以Cu·Zn-SOD活性较高,Mn-SOD、Fe-SOD活性较低,但Cu·Zn-SOD、Mn-SOD辅因子易于丢失,应用时应予以注意.

参考文献:

[1]张琪林,王红.大球盖菇液体培养碳氮营养源研究[J].食用菌.2002,24(1):6.

[2]王红,张琪林.大球盖菇液体培养与pH值关系研究[J].山西师范大学学报(自然科学版).2003,17(增1期):108~109. [3]王红,张琪林.大球盖菇液体培养胞外酶特性研究[J].食用菌.2003,25(2):8~9.

[4]李中振,田廷亮.灵芝超氧化物歧化酶同工酶研究[J].中国食用菌.1997,16(4):32~34.

相关话题

hxf119

第1楼2011/08/13

不错的文献

0

zhxq1970

第2楼2011/08/17

不错的文献谢谢！

0

ztyzxqgwf

第3楼2011/09/06

学习了，谢谢哦！

0

近期热榜

热门活动

猜你喜欢最新推荐热门推荐更多推荐

品牌合作伙伴

日立科学仪器

珀金埃尔默仪器（上海）有限公司（PerkinElmer）

珀金埃尔默仪器（上海）有限公司（PerkinElmer）

日本电子株式会社

赛默飞世尔科技

马尔文帕纳科

上海仪电科仪

梅特勒托利多

布鲁克核磁

举报帖子

点赞用户

好友列表

加载中...

正在为您切换请稍后...