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【求助】如何消除溶液颜色对吸光度的影响

紫外可见分光光度计(UV)

  • 我是用UV-2550中的动力学模块测酶活。(锰过氧化物酶MnP酶活测定方法: 先将0.2113g MnSO4 溶解于1 L 酒石酸缓冲液( 50mmol·L - 1 ,pH = 4.5) 中,再取2.4 mL 的该溶液和0.6mL 粗酶液混匀,即得3 mL 反应液. 在30 ℃下,往此反应液中加80μL H2O2 溶液(20 mmol·L - 1 ) 启动酶促反应,并在290 nm 波长下测定反应2 min 前后的反应液吸光度变化. 一个酶活力单位(U) 定义为每分钟氧化Mn2 + 产生1μmol Mn3 + 所需的酶量.)发现有些酶液的颜色较深(非纯酶液,而是用锰过氧化物酶降解木质素后的发酵液 ,棕黄色,黄褐色那样),从而无法实现自动调零,作出来的曲线也是波动特别大,锯齿状,没法读数。请问各位有没有好的解决方法?仪器操作上的或者是酶液的预处理方面的都可以
    谢谢了
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  • tutm

    第1楼2009/05/15

    估计你的试样溶液时浑浊的,建议你将待测试样溶液过滤一下再测

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  • tutm

    第2楼2009/05/15

    还有,你现在的吸光度可能也太高,需要稀释再测

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  • tutm

    第3楼2009/05/15

    估计你的试样溶液是浑浊的,建议你将待测试样溶液过滤一下再测

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  • hc1027

    第4楼2009/05/15

    我是用微孔滤膜(0.45微米)过滤的,结果就是上面的那样。每次我都稀释(酶液量减为原来的二分之一),结果吸光度也不是很大,不到0.05,不敢稀释了。估计是色度太大了,影响测试,但具体怎么消除这个影响不怎么清楚。

    我是第一次用UV-2550,别人告诉我的操作方法(动力学)是:“连接后,设置时间3min,波长为290nm,然后设置基线为300nm到280nm,再到波长290nm,然后放入两个比色皿(都含反应液,完全一样),自动调零,再向非参照样中加入H2O2启动反应,再点击开始。”请问这样操作有问题吗?

    http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20081113/1584244/我在这个帖子里看到“1 先输入波长范围,点击基线校正(baseline)
    2选择到波长500纳米,点击自动调零。
    原因:一般分光光度计的能量在500纳米左右最强,在此自动调零可以得到最正确的基线。”,与我的操作矛盾吗?

    tutm 发表:估计你的试样溶液时浑浊的,建议你将待测试样溶液过滤一下再测

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  • tutm

    第5楼2009/05/16

    你是使用290nm单色光测试样品,因此色度(可见光区域的吸收)不会有影响。

    请你将参比先换成空白溶液,看反应液的起始吸光度是多少,如果大于1,请稀释至1以下。

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  • hc1027

    第6楼2009/05/16

    谢谢,我会再试试的

    我是第一次用UV-2550,别人告诉我的操作方法(动力学)是:“连接后,设置时间3min,波长为290nm,然后设置基线为300nm到280nm,再到波长290nm,然后放入两个比色皿(都含反应液,完全一样),自动调零,再向非参照样中加入H2O2启动反应,再点击开始。”请问这样操作有问题吗?

    http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20081113/1584244/我在这个帖子里看到
    “1 先输入波长范围,点击基线校正(baseline)
    2选择到波长500纳米,点击自动调零。
    原因:一般分光光度计的能量在500纳米左右最强,在此自动调零可以得到最正确的基线。”,与我的操作中到波长290nm矛盾吗?

    tutm 发表:你是使用290nm单色光测试样品,因此色度(可见光区域的吸收)不会有影响。

    请你将参比先换成空白溶液,看反应液的起始吸光度是多少,如果大于1,请稀释至1以下。

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