【极限体验&第二届原创大赛参赛作品】小木新作—一未知化合物液相色谱质谱分析方法的建立

2.实验内容
2.1 试剂及仪器
2.1.1 试剂：
甲醇，色谱纯级，购自Fisher；去离子水，自Milli-Q；乙酸乙酯，分析纯级，购自Fisher；甲酸，分析纯级，购自北京试剂。
2.1.2 仪器
Agilent 1200高效液相色谱仪
AB公司API 3200 Q-TRAP三重四级杆质谱仪
色谱柱为：Ultimate LP—C18 （5μm， 3.0*100mm）

2.2 色谱质谱方法的建立
2.2.1 质谱方法的建立
通常，发展质谱方法可采用直接注射法、进样泵法和液相色谱导入法。由于我们在试验中应用的是3200 Q-TRAP这款仪器，它自带进样泵，因此我们采用进样泵法。
首先，根据化合物A的性质，我们选用DMSO作为溶解样品的溶剂。为什么选择这个溶剂呢？因为它难挥发，这样就保证了样品浓度的一致性；因为溶解性好，基本能溶解所有的非盐类化合物。接下来将化合物A和内标B制备成浓度均为300ng/mL的溶解，用于质谱方法的建立。
第一步，对化合物A进行Q1扫描。在这步操作中，主要优化DP电压，确定A的母离子，原则就是尽量选择分子离子峰——稳定，结果重现性好。
第二步，确定子离子和合适的碰撞能。确定了母离子后，进行子离子扫描。在选择子离子的过程中，可能会出现两个、三个甚至更多的子离子，丰度较大。遇到这种情况，不要着急确定哪个子离子更为合适，可以先留着，在进行infusion的时候，将这几个离子对都输入进去，经过仪器的自动优化，看看哪个离子对的响应强度更高，更为稳定。
第三步，infusion和FIA。由前面两步，我们可以初步确定用于定量检测和定性检测的离子对，然后进行infusion操作。这步操作主要用于确定基本的质谱参数，如DP、CXP、CEP、EP等。上述参数确定后，保存此方法，连上HPLC，设定HPLC洗脱程序，进行FIA。此操作主要是系统的优化源参数和化合物的参数。优化完毕后，系统会自动的保存一个方法。至此，化合物A的质谱方法建立完毕。

内标B的优化方法同A。
质谱方法如下：

2.2.2 色谱方法的建立
第一步，添加剂的选择
在优化色谱条件时，首先考虑选择何种添加剂。由于化合物A呈弱碱性，而且我们采用正离子作为检测模式，所以为了保证化合物既在色谱柱上保留，又能够充分的进行离子化，选择0.1%的甲酸作为水相和有机相的添加剂。
第二步，色谱柱的选择
在确定添加剂后，我们对色谱柱进行了考察。手头主要有两款，一是C18 （5μm， 2.1*150mm），另一款是Ultimate LP—C18 （5μm， 3.0*100mm）。在使用C18色谱柱时，流速为0.4mL/min、甲醇-水（0.1%甲酸）比例为70：30的条件下，系统压力大约在150bar左右。产生这么高的压力，可能原因有两个——一是柱子的内径为2.1um的；二是这款柱子相对于质谱常用柱而言，长度比较长，从而导致柱压较高。我们尝试了等度和梯度洗脱两种方式，但色谱峰的峰形均不理想。
色谱图如下：

后来我们看到月旭公司正在仪器信息网搞色谱柱免费申请试用活动，遂联系月旭公司相关负责人。他们根据我试验的具体情况，向我推荐了Ultimate LP—C18 （5μm， 3.0*100mm）这款色谱柱。接上色谱柱，按照说明书进行了柱子活化。
第三步，洗脱方式的选择
然后考察了等度和梯度洗脱对色谱峰的影响。在等度洗脱条件下，甲醇-水在50：50时，化合物和内标在1min内出峰，这在进行生物样品分析时很难祛除内源性物质的干扰，也就无法避免基质效应对试验的影响。我们尝试增加水相的比例，但水相高的情况下化合物进入离子源后离子化效率降低，从而导致灵敏度降低。
等度洗脱色谱图


接下来我们考察了梯度洗脱，在初始流动相-水相为90%时，化合物A和内标B在6min左右出峰，总分析时长是10min。对于生物样品分析尤其是液质联用的高通量分析，分析时长太长。我们继续对这个洗脱条件进行优化，最后将A和B的出峰时间调节到5min左右。
梯度洗脱色谱图


色谱方法如下：

2.3    样品预处理方法的建立
常用的样品预处理方法主要有沉淀蛋白法、液液萃取法和固相萃取法。由于第三种由于固相萃取小柱价格昂贵，老板不给购买~~~，这里主要讨论前面两种方法。
首先，我们考察了沉淀蛋白法。沉淀试剂主要是甲醇和乙腈，考察了2倍量、三倍量对提取回收率的影响。结果显示，经这两种沉淀试剂处理后进样，乙腈三倍量提取后的化合物A和内标B的峰高高于其他处理方法的。但是所有的色谱图背景噪音（基线）较大，而且内源性物质干扰很明显。同时，鉴于化合物的化学性质，也考察了碱化试剂对提取回收率的影响。结果显示，碱化试剂对其响应影响不大。
在上述情况下，我们考察了液液提取法。提取试剂主要有甲基叔丁基醚，正己烷，二氯甲烷，乙酸乙酯以及正己烷-二氯甲烷3：1等。结果显示，乙酸乙酯的提取回收率最高，这可有相似相容原理来解释。使用乙酸乙酯唯一的缺点就是——氮气吹干浓缩时，浓缩速率慢，成了整个试验的限速步骤。
氮吹仪装置图

2.4    结果
在色谱质谱方法建立后，在样品预处理方法确定后，我们就对此方法进行了系统的方法学确定试验。主要项目有系统适应性试验、方法的灵敏度专属性试验、Carry-over评价试验、基质效应试验、标准曲线和线性范围、准确度和精密度试验、回收率试验。主要色谱图如下：
Blank



Zero




由上面两图得知，内源性的物质不干扰待测物A的测定，内标B也对A的测定无干扰。

LLOQ



A：Analyte, B:Internal Standard

由上图和blank两张图得知，信噪比S/N大于5，满足定量要求。

LQC




HQC

标准曲线




由上图得知，该化合物在线性范围内线性良好。。

3.    结论
通过这个试验，掌握了液质联用仪的正常使用、日常维护等工作，并对生物样品的分析有了基本的了解。更为重要的是，使用Ultimate的色谱柱分析了100个左右的生物样品，在试验前后色谱柱的压力变化不大，而且色谱峰的峰形保持良好。虽没有像仪器厂家测定柱效那样来评价色谱柱的优劣，但通过试验也间接的反应出该色谱柱对于本实验还是很适合的，跟老板商量商量，最好能买下来。
最后，祝愿月旭色谱柱试用活动和仪器信息网第二届原创大赛活动取得圆满成功。

上文还缺几张色谱图和具体的色谱质谱条件，会尽快补充完整，也欢迎各位版友拍砖，谢谢。。。