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【原创】多重PCR

gotobio111

2010/04/29

一．原理：

在PCR中使用一对以上的引物，同时扩增目的DNA中的几个片段。

必须确保反应中所有引物有相近的熔解温度，引物之间不会发生相互作用，扩增产物大小相近但又能够通过电泳分开。

l确保所有靶位点可以用相同的PCR程序在单个反应中得到有效的扩增。

l在使用相同的PCR程序和反应条件的单个PCR中对每对引物的量进行优化已达到最大的扩增效率。

l平衡多重PCR中每对引物的量使之对每个靶位点都能获得足够的扩增量。

二．设计策略：

（首先要考虑的因素：引物的量）

1. 平衡多重PCR中每对引物的量。使之对每个靶位点都能获得足够的扩增量。

若其中某几个靶位点的扩增产物很少甚至没有，则逐步增加扩增效率低下的引物的浓度，同时减少扩增效率高的引物的浓度。

（再考虑调整反应条件）

2.若优先扩增长的PCR产物，最佳的选择是设计系列实验，依次递增的KCl浓度（1-2倍）和固定的Mg2+浓度（1.5mmol/L），对每对引物的量进行再优化。

若倾向于扩增较短的产物，则应该在保持KCl浓度不变的情况下逐步增高Mg2+的浓度（直至4.5mmol/L）。

3.若所有产物的扩增效率都很低，试着提高模板和热稳定DNA聚合酶的浓度。如果没有改善，成倍的增加所有引物的浓度并采用复性和延伸温度依次降低2℃的降落PCR。

4.若非特异性扩增较为严重，通过一系列只含有一对引物的PCR反应来确定是由哪一对引物产生的非特异性扩增；若不能归结为任何一对特定的引物，则考虑是由一对引物的正向引物和另一对引物的反向引物引起的，则设置一系列依次减少一对引物的多重PCR，通过排除法，确定是哪两条引物产生的非特异性扩增。

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