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western blot protocol（蛋白凝胶电泳实验）

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2024/10/08

western blot

1、先将制胶玻璃板用洗涤剂清洗干净,室温或干燥箱中烘干；

2、将烘干完全的制胶板固定在制胶架上，保持下端齐平，紧贴泡沫垫；

3、配置下层胶，轻轻晃荡10秒，加入制胶板中，不能有气泡。加至刻线处，再用水将制胶板内层填满，静置40min（若温度低时可适当延长静置时间）；

4、倒掉水，并用滤纸将残余水分洗掉，配置上层胶，轻轻晃荡10秒，加入制胶板中。加满制胶板内层，插入插槽，再添加上层胶覆盖插槽，静置40min（若温度低时可适当延长静置时间）；

5、将制胶板置于电泳槽中，加入电泳液，平滑拔出插槽，加入提前制备好的蛋白样（制备方法：冻存在-80℃的细胞样中加入100ul蛋白裂解液，冰上震荡10min（震荡30s-冰上15s），12000rpm离心5min，如果上清还有絮状物继续离心5min，收集上清与5Xsample buffer混合后沸水5min,置于-80℃保存），150V，电泳1h；

6、提前20min，将转膜需要的6层滤纸、泡沫布、转膜夹、膜放入转膜液中（转膜液需要在western之前配好放入4度中），清除气泡；

7、将胶小心取出，只保留有样品部分，使转膜夹白色面向下，按照泡沫垫、3层滤纸、膜、胶、3层滤纸、泡沫垫的顺序摆好，清除气泡、夹上转膜夹；

8、将转膜夹置于转膜槽中，加入转膜液，转子。整个装置处于4度中，350mA，1h；

9、转膜完后，将膜置于1%BSA的TBST中，封闭1h。置于摇床上，室温最低速摇晃；

10、一抗（浓度按照说明书推荐的中间量，之后做适当调整）4度过夜；

11、 TBST 清洗三遍，每遍15min；

12、二抗避光孵育1h，室温置于摇床，最低速摇晃（1:20000）

13、 TBST 清洗三遍，每遍15min；

14、曝光观察，DAB显色液A液和B液提前几分钟混合，然后滴于膜上需要显影的区域，避光反应5min；

15、置于凝胶成像系统获取照片，利用图像分析软件定量分析。

液体配置：

胶：

（单位：ml）

去离子水

30%PAGE

Tris buffer

10%SDS

10%APS

TEMED

下层胶

2.05

1.65

1.25（8.8）

0.05

0.025

0.0025

上层胶

2.85

0.85

1.25（6.8）

0.05

0.025

0.005

转膜液：700ml 去离子水+200ml 甲醇+100ml10X Tris/ Glycine Buffer）（现用现配，提前1-2h放于四度）

电泳液： 10X Tris/Glycine/SDS Buffer(可反复使用)

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