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RNA提取及逆转录protocol

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2024/10/08

一、总RNA 提取
总RNA提取是分子生物学实验中常见的技术步骤，用于从细胞或组织样本中分离和纯化总RNA。以下是一个常见的总RNA提取流程及注意事项：

1、一切使用器材（各种类枪头，ep管等）均需要无酶。可直接购买无酶器材或将器材在实验前一天浸泡于DEPC水中过夜，烘干使用。

2、整个操作过程最好在冰上进行。

l 实验步骤：

1. 将细胞培养液倒掉，立即加入Trizol试剂，每瓶1ml，反复吹打，室温静置5-10min；

2. 将细胞吸入1.5ml EP管中，每管加入200ul氯仿，旋窝振荡器剧烈震荡15s，冰上孵育5min；

3. 4℃、12000g离心15min，收集上层无色水相到新的1.5ml EP管中（此处离心后ep管中会分为3层，上层透明：RNA；中层乳白：DNA；下层红色：蛋白及细胞碎片，收集上清液切记不可贪多，切勿将DNA误吸）

4. 加入等量异丙醇（约500ul），轻柔颠倒混匀（沉淀RNA）；

5. 4℃、12000g离心15min，弃上清；

6. 加入1ml 75%乙醇并震荡（将沉淀弹起即可，乙醇要用DEPC水配制，若提取miRNA建议乙醇浓度为80%，洗涤效果更好）；

7. 4℃、12000g离心5min，弃上清；

8. 空气中（超净台内）干燥20-25min；

9. 加入20-30ul DEPC水溶解RNA；

10. 分装后，-80℃保存。

二、逆转录（包括miRNA逆转录）

a) 总RNA逆转录

RT master mix

4ul

总RNA

2000ng

Rnase-free water

补足至20ul

反应条件：37℃---15min 85℃---5s 4℃---end

逆转录结束后cDNA可以长期保存于-20℃。

b) miRNA逆转录（加尾法）

RT solution mix

10ul

Enzyme mix

2ul

总RNA

2000ng

Rnase-free water

补足至20ul

反应条件：37℃---60min 85℃---5min 4℃---end

逆转录结束后cDNA可以长期保存于-20℃。

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