【艾杰尔专题讲座】手把手教你如何建立合适的固相萃取（SPE)方法，欢迎您来提问~

·固相萃取吸附剂与目标化合物之间的作用机理

固相萃取主要通过目标物与吸附剂之间的以下作用力来保留/吸附的

1） 疏水作用力
2） 离子交换作用
3） 物理吸附

·p H值对固相萃取的影响

pH值可以改变目标物/吸附剂的离子化或质子化程度。对于强阳/阴离子交换柱来讲，因为吸附剂本身是完全离子化的状态，目标物必须完全离子化才可以保证其被吸附剂完全吸附保留。而目标物的离子化程度则与pH值有关。如对于弱碱性化合物来讲，其pH值必须小于其pKa值两个单位才可以保证目标物完全离子化，而对于弱酸性化合物，其pH值必须大于其pKa值两个单位才能保证其完全离子化。对于弱阴/阳离子交换柱来讲，必须要保证吸附剂完全离子化才保证目标物的完全吸附，而溶液的pH值必须满足一定的条件才能保证其完全离子化。

·固相萃取操作步骤及注意事项

针对填料保留机理的不同（填料保留目标化合物或保留杂质），操作稍有不同。

1.填料保留目标化合物

固相萃取操作一般有四步（见图1）：

Ø 活化---- 除去小柱内的杂质并创造一定的溶剂环境。（注意整个过程不要使小柱干涸）
Ø 上样---- 将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分保留在柱上。（注意流速不要过快，以1ml/min为宜）
Ø 淋洗---- 最大程度除去干扰物。（建议此过程结束后把小柱完全抽干）
Ø 洗脱---- 用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。（注意流速不要过快，以1ml/min为宜）

图1

图2 固相萃取操作步骤（填料保留杂质）

固相萃取方法的建立与优化

·固相萃取方法的建立步骤
·固相萃取方法的优化技巧
·固相萃取小柱的选择技巧


固相萃取技术使用起来虽然比液液萃取简单，但建立一个固相萃取的方法并无快捷方式可走。建立固相萃取方法必须考虑与萃取过程相关的多种因素，归纳起来可从三个方面考虑：即确定萃取的目的及要求、建立初步的固相萃取方法、方法的优化。

1．确定萃取的目的及要求
①-②-③

2.初步固相萃取方法的建立

建立初步的萃取方法要考虑：

l 选择合适的SPE柱
l 选择合适的固相萃取方法
l 方法的优化

2.1．固相萃取柱的选择
a) 柱填料的选择
首选根据目标化合物与干扰物的差异，如极性，分子量，pka值等，选择合适的填料。



2.2 固相萃取柱规格的选择
对于反相、正相和吸附型固相萃取柱来说，被萃取样品的质量不超SPE柱填料的5%；
离子交换型的固相萃取柱，必须考虑离子交换的容量。SAX和SCX其吸附容量为0.2mg/g，下表附SPE小柱的容量和洗脱参数

SPE柱上样容量和洗脱体积的选择

2.3．选择合适的固相萃取方法

固相萃取的保留机制可分为两种：

2.3.1 吸附剂（填料）保留目标化合物：绝大多数化合物应用此机制，填料保留其目标组分及少量杂质，通过淋洗步骤去除吸附在柱上的少量杂质，最后选择合适的（洗脱）溶剂把目标组分洗脱下来。

根据吸附剂的保留机理可进一步分为：

（1）反相（C18,C8,CN,Phenyl,C4,C1）

• 分析物：非极性至中等极性
• 基质：水溶性
• 方法：
1.活化：通常用水溶性有机溶剂如甲醇活化，然后用水平衡
2.淋洗：含0-50%极性溶剂的缓冲溶液淋洗杂质
3.洗脱：极性或非极性溶剂洗脱目标物

（2）正相（Silica, Florisil,Diol,NH₂）
• 分析物：中等极性到强极性
• 基质：非极性至中等极性
• 方法：
1.活化：非极性有机溶剂
2.洗脱：非极性有机溶剂

（3）阳离子交换（SCX,PRS,COOH）
• 分析物：阳离子（碱性）化合物
• 方法：
1.活化：用于非极性有机溶剂中的样品时，可用样品溶剂来活化；在用于极性溶剂中的样品时，可用水溶性有机溶剂过柱后，然后用水平衡，最后再用适当pH值的缓冲溶液进行平衡。
2.上样：样品溶液pH值要小于其pKa两个单位（以保证其带电荷 ）
3.洗脱：洗脱溶液pH值要大于其pKa两个单位（中和分析物的电荷）

（4）阴离子交换（SAX,PSA,NH2，PAX/MAX ）
• 分析物：阴离子（酸性）化合物
• 方法：
1.活化：用于非极性有机溶剂中的样品时，可用样品溶剂来活化；在用于极性溶剂中的样品时，可用水溶性有机溶剂活化后，然后用水平衡，最后再用适当pH值的缓冲溶液进行平衡。
2.上样：样品溶液pH值要大于其pKa两个单位（以保证其带电荷 ）。
3.洗脱：洗脱溶液pH值要小于其pKa两个单位（中和分析物的电荷）。

2.3.2 吸附剂（填料）保留杂质：食品中色素等杂质的去除多用此机制。填料保留杂质而不保留或只保留极少量的目标组分，所以上样后即开始收集目标组分，最后用目标物所在的溶剂进一步洗脱。合并两部分收集液。

1.活化：以样品所在的有机溶剂进化活化，1-2柱管体积
2.上样：提取液转移至柱内，并收集流出液
3.洗脱：用样品所在的有机溶剂进一步洗脱，收集流出液。合并上样和洗脱流出液。

3．固相萃取方法的优化

3.1．影响萃取效率的因素

1）填料（固定相）----- 核心
选择合适的SPE柱是保证理想结果的前提

2）洗脱溶剂的强度：
Ø 采用正相固定相时，溶剂强度随其极性增强而增加；
Ø 采用反相固定相时，溶剂强度随极性减弱而增强。

3）pH值：
离子交换固定相、被分析物和干扰物质的pKa各不相同。通过调节pH大小，可以使固定相带电荷，被分析物带相反电荷，而使干扰物质不带电荷；或者反过来，使固定相带电荷，干扰物质带相反电荷，而使被分析物不带电荷。

4）其他…..

3.2常见问题及解决方法

l 分析物回收率低
l 萃取重现性差
l 洗脱馏分中含有干扰物
l SPE柱流速降低或阻塞

具体解决方案如下：

1）分析物回收率低
• 未保留？
• 被淋洗？
• 未被洗脱或部分洗脱？

首先要把上样液、淋洗液、洗脱液均收集，进样分析，确定问题来源

固相技术应用实例解析

·固相萃取技术在食品分析方面的应用实例解析

·固相萃取技术在环境领域中的应用实例解析

·固相萃取技术在药物分析中的应用实例解析

建议：每个应用领域可配1-2个实例进行介绍，被检测物质建议以常见物质为主。

1.食品领域应用

动物组织中盐酸克仑特罗等4种β-激动剂药物残留检测（Cleanert PCX, P/N: CX1506）
1.实验材料

1.1 固相萃取小柱：PCX(150mg/6mL)

1.2 四种β-激动剂药物：盐酸克仑特罗、沙丁胺醇、西马特罗、莱克多巴胺等4种β-激动剂药物。

2. 试样的制备

取猪肝空白样品，经过液液萃取初步处理后，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试样。

3. 净化

依次用甲醇5mL、水5mL和30mmol/L盐酸5mL润洗固相萃取小柱，将上述备用液过柱，依次用水5mL、甲醇5mL淋洗，真空抽干，用4%氨化甲醇5mL洗脱PCX小柱，收集洗脱液于具塞玻璃试管中，50℃下氮气吹干。在样液过柱和洗脱过程中流速控制在1mL/min左右。

4. 衍生化及检测

将上述盛有残渣的具塞玻璃试管放入50℃烘箱中加热片刻，除去水分后，加入甲苯100mL和双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）100mL，涡旋振荡20s，密封玻璃塞，置于80℃恒温烘箱中加热1小时，冷却后加入300mL甲苯，作为试样溶液，供气相色谱-质谱分析（色谱柱：DA-5MS, 30m×0.25mm×0.25µm，P/N:1525-3002）。

5. 结果

5.1 回收率实验（精密度和准确度）

将猪肝空白样品经过液液萃取初步处理后，分别添加一定量的标准溶液，配制1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L和100μg/L五个浓度的试样溶液，每批次内同一浓度做5次平行实验，共4个批次（样品典型回收率色谱图见附图）。

猪肝中实验结果列表如下


5.2重复性实验（批间误差实验）：

猪肝中实验结果列表如下

鸡蛋中三聚氰胺的检测（Cleanert PCX, P/N: CX0603）

1 材料和方法

1.1 主要仪器和试剂，

色谱柱（Venusil ASB C8，4.6*250mm，5μm，艾杰尔科技），混合型阳离子交换固相萃取柱（Cleanert PCX，60mg/3mL，艾杰尔科技），12位固相萃取装置（艾杰尔科技），高效液相色谱仪；高速离心机；超声波震荡仪；涡旋混合器；分析天平（万分之一）；溶剂过滤器（带0.45μm有机、水系过滤膜和真空泵）；乙腈（HPLC级）；三聚氰胺标准品（≥99.0%）；柠檬酸（分析纯）；庚烷磺酸钠（色谱级）；水（二次蒸馏水以上）。

1.2 色谱条件：
色谱柱：Venusil ASB C8，4.6*250mm，5μm；
流动相：乙腈∶10mM/L柠檬酸+10mM/L庚烷磺酸钠缓冲液=7∶93（pH=3.0）
检测波长：240nm；流速：1mL/min；进样20μL。

2 实验部分

2.1 三聚氰胺标准溶液配制：
称取三聚氰胺标样10.0mg，加流动相溶解定容至100mL，即得浓度为100mg/L的三聚氰胺标样溶液。将浓度为100mg/L的三聚氰胺标准溶液分别用水稀释成浓度为1mg/L 、5mg/L 、10mg/L 、15mg/L 、20mg/L的标准品溶液，用0.45μm滤膜过滤后进液相色谱检测。

2.2 1%三氯乙酸溶液溶液的配制
称取三氯乙酸1.00g，加水溶解定容至1000mL即得。

2.3 5%氨化甲醇的配制
准确量取5mL氨水和95mL甲醇，混匀后备用。

2.4 5%醋酸铅溶液的配制
称取5.0g醋酸铅，加水溶解定容至100mL即得。

2.5 混合型阳离子交换固相萃取柱（Cleanert PCX 60mg/3mL）的活化
取Cleanert PCX 固相萃取柱，以3mL甲醇，3mL水依次过柱活化，弃去流出液，备用。

2.6 加标样本处理

将鸡蛋打开搅匀，分别称取1.00g鸡蛋样本置于10mL具塞离心管中，分别加入100mg/L三聚氰胺标样溶液10μl、20μl、100μl，分别得到添加浓度为1.0mg/kg、2.0mg/kg、10.0mg/kg的样本。

往装有上述样本的具塞离心管中分别加入10mL 1%三氯乙酸溶液，2mL 5%醋酸铅溶液，摇匀，超声20分钟，8000rpm离心10分钟，全部上清液转入活化好的混合型阳离子交换固相萃取柱（Cleanert PCX，60mg/3mL），依次使用3mL水，3mL甲醇淋洗，抽干，弃去淋洗液。最后用5mL 5%的氨化甲醇洗脱（V/V），接收洗脱液，50℃氮气吹干，用1mL流动相定容，0.45μm滤膜过滤后进液相色谱检测。

另取空白鸡蛋样本1.00g，不添加三聚氰胺照上述方法处理，作为空白对照样品。

3 实验结果：

3.1 峰型与分离度
分别取鸡蛋空白样品和鸡蛋添加10ppm的样品进样，结果见图1.

图1 鸡蛋空白样品和鸡蛋添加10ppm的样品图谱

表1 保留时间与峰面积的稳定性数据

由表1结果可见，本方法具有很好的精密度和重现性。

3.3 标准校正曲线

表2 标准校正曲线实验数据

根据以上数据计算线性方程为：y = 87.43x - 13.67， R² = 0.999 ，相关曲线见图2。

图2 浓度与峰面积的回归曲线

结果显示，该方法在1~20mg/kg范围内线性关系良好。

3.4 添加回收率
表3 添加浓度与回收率数据

由表3可见，本方法检测鸡蛋中三聚氰胺回收率较好。

4 结论

通过上述实验可见，运用本方法测定鸡蛋中三聚氰胺，基质净化效果好，杂质干扰小，色谱峰型良好对称度高，操作简单方便，和准确度高等优点，非常适用于鸡蛋中三聚氰胺的检测。

2．环境检测应用

水中酚类检测（Cleanert PEP, P/N: PE0603）

1 实验材料：

1.1 SPE小柱：Cleanert PEP 500mg/6mL
1.2 7种酚类：苯酚，4-硝基酚，间甲酚，2-氯酚，2,4-二氯酚，2,4,6-三氯酚，五氯酚

2 实验过程

2.1．样品前处理方法

1） 活化：依次用5mL甲基叔丁基醚（10:90，V/V）、5mL甲醇活化富集柱、5mL去离子水活化Cleanert PEP柱，5mL/min
2） 上样：1L的水样过柱，<5mL/min
3） 淋洗：10mL去离子水淋洗小柱，5mL/min，然后真空抽干20min
4） 洗脱：2mL甲醇/甲基叔丁基醚（10:90，V/V）分两步洗脱，收集洗脱液至尖嘴瓶中
5） 浓缩：将收集的2mL洗脱液，氮气浓缩至1mL

2.2．色谱条件

色谱柱：Venusil MP C18(4.6*150,5µm)
流动相：A：1%乙酸
B：1%乙酸甲醇
检测器：UV检测器
梯度洗脱程序：

图1. 七种酚的色谱图

注： 1、苯酚 2、4-硝基酚 3、间甲酚 4、2-氯酚 5、2,4-二氯酚 6、2,4,6-三氯酚 7、五氯酚


三．实验结果

七种酚在水中的添加回收率见表1.

表1. 七种酚类在水中的添加回收率结果

水中硝基苯的固相萃取方法（Cleanert PEP, P/N: PE0603）

1．SPE柱：Cleanert PEP（500mg/6mL）

2．样品制备：分析前应先调节水样pH值为中性，向每份水样中加人甲醇使甲醇浓度为0.5%。混匀。

3．SPE方法：

1）PEP柱活化：将 PEP柱置于固相萃取装置的针座圈上，用3mL正己烷预洗萃取柱，加人5mL甲醇，在甲醇完全流过萃取柱前加入10mL试剂水，使柱床处于湿润和活化状态。

2）．样品的富集：根据水样浓度准确量取适量水样于分液漏斗中，开启固相萃取装置真空系统，使水样连续通过活化过的萃取柱保持流速不超过5mL/min进行萃取，在萃取过程中要始终保持柱床上至少有1cm高水样。当所有样品都通过萃取柱后，用10mL超纯水冲洗分液漏斗内壁，继续真空抽吸20min。

3）干燥柱预处理：向带筛板的干燥管中加入5g处理过无水硫酸钠，使用前分别用10mL丙酮和正己烷,再以10mL丙酮洗以净化干燥柱

4）萃取柱的洗脱：保持管线的连接，在真空多管装置的萃取缸中放人试管架及接收管，在针座圈和萃取柱之间连接干燥柱用于脱水，用1mL丙酮过渡，弃去过柱液（该步骤不要吹干，让丙酮和柱内填料平衡2min），10mL正己烷/丙酮(90:10，V/V)洗脱萃取柱，洗脱经过干燥柱（与PEP柱串联），收集流出液至接受管中，用氮吹仪在40℃下浓缩至1.0mL，进样分析（需要观察有无分层，水会引起分层，影响氮吹）。