小卢
第1楼2010/07/09
3 实验过程
3.1样品检测分析
3.1.1首先用流动相B,检测蓝色葡聚糖2000、对照品溶液;然后换流动相A检测蓝色葡聚糖2000、系统配制溶液、样品溶液。进样品溶液前,应该先保证系统适应性要求的项目合格。
系统走流动相B(水),当基线平稳后,
3.1.1.1进蓝色葡聚糖2000(浓度:0.5mg/ml)100ul,得数据:理论塔板数: 594 拖尾因子: 0.849
图谱如下:
3.1.1.2进对照品溶液(浓度约:0.1mg/ml),称取对照品(1):26.27mg溶于250ml水中,进样3针;对照品(2):24.94mg溶于250ml水中,进样2针,通过峰面积计算校正因子,得数据:平均值:1.0165×10-3 RSD为0.2%
计算对照液主峰与蓝色葡聚糖2000峰保留时间的比值,由图谱可得如下数据:
对照品1-1:6.464/6.632=0.97
对照品1-2:6.468/6.632=0.98
对照品1-3:6.464/6.632=0.97
对照品2-1:6.460/6.632=0.97
对照品2-2:6.460/6.632=0.97
图谱如下:
3.1.2更换流动相A(pH7.0缓冲盐),冲洗色谱柱约30min-60min,基线平稳后,
3.1.2.1进蓝色葡聚糖2000(浓度:0.5mg/ml)100ul,得数据:理论塔板数:1142 拖尾因子:1.503
两种流动相中蓝色葡聚糖2000的保留时间比为: 6.551/6.632=0.99
图谱如下:
3.1.2.2进系统适应性溶液(浓度:20mg/ml的0.4mg/ml的蓝色葡聚糖2000溶液)100ul,得数据:
高聚体的峰高与单体与高聚体之间的谷高比:594/45=13.2
图谱如下:(为了计算方面,下图为上图放大后计算谷高比的图谱)
3.1.2.3进供试品溶液100ul(浓度约:20mg/ml,称取某公司头孢曲松钠原料药0.2043g至10ml量瓶),通过校正因子计算聚合物含量,得数据:
聚合物%=校正因子*供试品峰面积*10/供试品称样量/250/1000*100%=0.2%
供试品溶液中聚合物峰与蓝色葡聚糖2000峰保留时间的比值:6.649/6.551=1.01
图谱如下:
3.1.3小结:从以上谱图和数据可以看出该色谱系统符合实验条件,所得数据有效,agilent1100液相色谱仪和高压填充色谱柱可以满足头孢曲松聚合物的检测。总结数据,通过表格形式列出后,如下:
小卢
第2楼2010/07/09
3.2寻找梯度洗脱方法
从3.1项方法分析,此液相系统适合头孢曲松钠聚合物的测定,但从系统配制溶液和供试品溶液峰来看,基线平稳运行时间较长,增加了分析时间。现在就寻找一种减少基线平稳的洗脱办法。
一般情况下,加快分析时间的方法为增加流速或调整流动相比例。而此系统流速为1.5 ml/min,如增加流速则仪器压力增加很高,对柱子和仪器的损害比较大,因此决定从流动相A和B比例上来分析。在3.1.2.3项方法中,在100%磷酸盐缓冲系统中,供试品保留时间约为82min;在3.1.2.2项方法中,系统适应性溶液保留时间约为100min。聚合物出峰时间约为6.6min,因此在样品运行10min后调整流动相A和B的比例。
3.2.1方案1:
系统平稳后,进供试品溶液,基线平稳时间约在65min,谱图如下:
3.2.2方案2:继续调整比例,看是否还能缩短分析时间,如下:
系统平稳后,进供试品溶液,基线平稳时间约在55min,谱图如下:
再进系统配制溶液,基线平稳时间约在65min,且谷高比符合要求,得谱图如下:
3.2.3小结:从上面分析可以看出,方案2可以使系统配制溶液基线平稳的时间由110min降到70min,供试品头孢曲松钠基线平稳的时间由85min降到55min,平均减少了35min,即节约了流动相,又减少了样品的分析时间,因此头孢曲松钠聚合检测时可以选择方案2的梯度洗脱方法。
结论:
通过3.1和3.2两个部分来看,使用高效液相色谱仪和高压填装不锈钢葡聚糖凝胶色谱柱能够满足头孢曲松钠聚合物的检测,并通过调整流动相比例在得到有效谱图的同时可以节约分析时间。因此,可以判断此方法能够满足头孢曲松钠聚合物检测的系统适应性要求,且能节约样品分析时间,而此过程所涉及的仪器设备可以通过国外认证机构的认可。因此,头孢曲松钠聚合物检测可以舍弃原来实验室自己组装的高分子杂质仪,而采用高效液相色谱仪(如agilent1100型)进行测定。
参考文献:
1. 2010版《中国药典》二部 第182页
2. 2005年版《中国药品检验标准操作规范与药品检验仪器操作规程》第93页—101页、第28页—131页
备注:具体的投稿内容在形式上和具体内容上会和这个帖子稍微有些不同,如果需要,我会在文章发表后上传!