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紫外可见分光光度计(UV)
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【资料】分光光度计的应用1- 核酸的定量
这站不远
2010/07/09
私聊
紫外可见分光光度计(UV)
分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸,蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。
分光光度计的简单原理
分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源,通过系列分光装置,从而产生特定波长的光源,光源透过测试的样品后,部分光源被吸收,计算样品的吸光值,从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸,单链、双链
DNA
,以及
RNA
。核酸的最高吸收峰的吸收波长
260 nm
。
每种核酸的分子构成不一,因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸,事先要选择对应的系数。如:
1OD
的吸光值分别相当于
50μg/ml
的
dsDNA
,
37μg/ml
的
ssDNA
,
40μg/ml
的
RNA
,
30μg/ml
的
Olig
。测试后的吸光值经过上述系数的换算,从而得出相应的样品浓度。测试前,选择正确的程序,输入原液和稀释液的体积,尔后测试空白液和样品液。然而,实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器,表现出的吸光值漂移越大。
事实上,分光光度计的设计原理和工作原理,允许吸光值在一定范围内变化,即仪器有一定的准确度和精确度。如
EppendorfBiophotometer
的准确度
≤1.0%
(
1A
)。这样多次测试的结果在均值
1.0%
左右之间变动,都是正常的。另外,还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的
pH
值,离子浓度等:在测试时,离子浓度太高,也会导致读数漂移,因此建议使用
pH
值一定、离子浓度较低的缓冲液,如
TE
,可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素:由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒,尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响,要求核酸吸光值至少大于
0.1A
,吸光值最好在
0.1-1.5A
。在此范围内,颗粒的干扰相对较小,结果稳定。
从而意味着样品的浓度不能过低,或者过高(超过光度计的测试范围)。最后是操作因素,如混合要充分,否则吸光值太低,甚至出现负值;混合液不能存在气泡,空白液无悬浮物,否则读数漂移剧烈;必须使用相同的比色杯测试空白液和样品,否则浓度差异太大;换算系数和样品浓度单位选择一致;不能采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
除了核酸浓度,分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度,如
A 260 / A 280
的比值,用于评估样品的纯度,因为蛋白的吸收峰是
280 nm
。纯净的样品,比值大于
1.8
(
DNA
)或者
2.0
(
RNA
)。如果比值低于
1.8
或者
2.0
,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。
A 230
表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,较纯净的核酸
A 260 / A 230
的比值大于
2.0
。
A 320
检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品,
A 320
一般是
0
。
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