zhangjianzhu
第4楼2010/09/01
小弟附上艾杰尔科技检测羟脯氨酸的方法，楼主可以参考一下；羟脯氨酸峰和其它氨基酸峰完全可以分开。
Agela Venusil AA HPLC法测定牛奶中羟脯氨酸
方法摘要：
Venusil AA 氨基酸分析的原理为目前广泛使用的PITC（异硫氰酸苯酯）衍生法。经过简化后的衍生方法有很多优点：方便、快速；衍生物单一、稳定，－20℃可贮存数月；采用Venusil AA 柱分析时间短；结果准确；试剂、副产物、溶剂等多种干扰因素可通过快速萃取去除；紫外检测（254nm）灵敏度高。
样品：
取某品牌牛奶0.5g，按照博纳艾杰尔氨基酸分析方法包进行水解衍生，并取混合氨基酸标准溶液（准确量取氨基酸标准溶液1.0 mL，置于5mL容量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液定容至刻度）加内标正亮氨酸，然后进行衍生。（异硫氰酸苯酯为衍生剂）
色谱柱：Agela Venusil AA，4.6×250mm，5µm，100Å（订货号：VA952505-K）
流动相：A：称取15.2g无水醋酸钠，加水1850mL，溶解后用冰醋酸调pH至6.5，然后加乙腈140mL，混匀，用0.45µm滤膜过滤。
B：80%（V/V）乙腈溶液
时间 | 流动相A |
0 | 0 |
2 | 0 |
15 | 10 |
25 | 30 |
33 | 45 |
33.1 | 100 |
39 | 100 |
39.1 | 0 |
45 | 0 |
lousha
第10楼2011/03/29
感谢【xiayuok】网友提出的问题。
1、样品前处理通常是按照农业部标准《GB T 18246-2000 饲料中氨基酸的测定》提供的水解方法进行。
2、刚才和【xiayuok】网友通了电话，经过我们双方的沟通，确认问题可能会出在：
“没有对酸水解的游离氨基酸溶液进行去除盐酸的步骤(吹干)，便直接加入了衍生剂PITC和衍生反应催化剂三乙胺TEA， 水解液中大量存在的盐酸中和了TEA，并且其中的盐酸相对于加入的TEA是过量的，过量的盐酸和氨基酸形成了氨基酸的盐酸盐（季铵盐），无法和衍生剂PITC反应形成硫酰胺衍生物，氨基酸仍然以未衍生的形式存在，导致了分离结果不理想二无法检测氨基酸”
具体原因解释：
1．博纳艾杰尔提供的 Venusil AA氨基酸分析方法包中，氨基酸和衍生剂异硫氰酸苯酯(PITC)的反应是在碱性条件进行的，该反应利用氨基酸氨基端的氢原子在碱性条件下的活泼氢和PITC的C原子进行加成反应，生成硫酰胺衍生物PTC-AA，在254nm下进行HPLC检测。
PITC和氨基酸衍生反应示意图
，季铵盐)，季铵盐的氢没有反应活性，无法和PITC反应形成硫酰胺衍生物，氨基酸仍然以未衍生的形式存在，直接导致了这次实验的失败。
赛默飞实验室产品焕新计划有奖调研！
【七月征文】不一YOUNG实验“猿”
报名开启：ICS2024第十三届光谱网络会议！
推荐收藏！盘点中药材及饮片检测解决方案
