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【第三届原创大赛】Sephadex LH-20使用全攻略

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2010/10/02

维权声明：本文为环烯醚萜原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。

Sephadex LH-20使用全攻略

凝胶背景介绍
《天然药物化学》一书中写道：凝胶的种类很多，常用的有葡聚糖凝胶（Sephadex G）和羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20）。其中，Sephadex G型只适于在水中应用，且不同规格适合分离不同分子量的物质；Sephadex LH-20可以在水、有机溶剂、或水+有机溶剂的混合溶剂中使用。
商品凝胶还有丙烯酰胺凝胶（Boi-Gel P）、琼脂糖凝胶（Sepharose Boi-Gel A）以及结合了不同离子交换基团的葡聚糖凝胶衍生物，如羧甲基交联葡聚糖凝胶（CM-sephadex）、二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶（DEAE-sephadex）、磺丙基交联葡聚糖凝胶（SP-sephadex）、苯胺乙基交联葡聚糖凝胶（QAE-sephadex）等等，分别具有不同的特色及应用范围。
本贴主要讲述Sephadex LH-20的相关内容，包括原理、洗脱溶剂、样品处理等方面内容。

Sephadex LH-20基础知识
Sephadex LH-20中的数字“20＝吸水量×10”，也就是说，该凝胶吸水量为2.0ml/g。
相比于硅胶、ODS、聚酰胺等填料，Sephadex LH-20很贵（具体价格不清楚，有兴趣可百度）。
注：就算是有钱的实验室，在使用凝胶的时候也是比较小心的，所以大家在使用的时候要多留意，不要污染，不要浪费等等。

Sephadex LH-20分离原理
1. 分子筛作用——按分子量大小分离物质（凝胶过滤作用），流动相一般为非极性溶剂。分子量大的化合物先被洗脱下来，分子量小的化合物后被洗脱下来。
2. 反相分配作用——流动相一般为反相溶剂，极性大的化合物先被洗脱下来，极性小的化合物后被洗脱下来。
注：我们一般使用的是其分子筛作用，对于反相分配作用则使用较少。不过，我曾听一位师姐说，她有一个样品在进行凝胶柱色谱的时候，分子筛作用不明显，后来是利用反相分配作用（甲醇/水系统）进行纯化的。

Sephadex LH-20流动相
1. 分子筛作用，常用的是甲醇、甲醇+氯仿混合溶剂。甲醇：氯仿一般为1：1左右，切不可用氯仿做为流动相！氯仿比重大，用单纯的氯仿做流动相，填料将浮起来，严重影响分离效果！！
2. 反相分配作用，常用的是甲醇/水，比例可以根据实际情况进行调整，也可以是梯度洗脱（跟反相高效液相相似）。
注：以上提到的流动相为本人实际操作过程中常用的，Sephadex LH-20还可使用其他很多溶剂作为流动相，如乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮等等，由于本人使用较小或者未曾使用，此处不妄加讨论。

样品的处理及洗脱过程
1. 最重要的一点：用尽可能少的溶剂溶解样品，样品可以很浓。如果溶解体积很大，一定要先进行浓缩，否则基本没有多大的分离效果。上样体积，按书上的说法，不宜超过柱子体积的1/10，我个人不爱计算这些，反正尽可能的少就对了。
2. 很重要的一点：尽可能用起始洗脱溶剂溶解样品（很多情况下样品并不能在起始溶剂中很好地溶解）。如果样品极性较大，可以使用甲醇或者一定比例的甲醇/水溶解；如果样品极性较小，可以使用少量氯仿溶解，然后加入少量甲醇稀释，或者直接用一定比例的氯仿/甲醇溶解。
3. 必须做到的一点：样品过滤，否则可能堵塞凝胶柱，还有可能对凝胶造成污染。另外，如果不过滤，样品中可能含有未溶解“样品颗粒”，这些颗粒将在洗脱的过程中慢慢溶解，到时候，所以的流分都会含有“样品颗粒”的成分，交叉严重。我们通常的做法是，在滴管内塞入棉花，用力“堵”上，然后过滤就可以上样了。没有必要用过滤膜或者滤头等相对“高级”的过滤系统。
4. 凝胶的洗脱，速度要慢，一般而言，速度越慢效果越好。我一般控制在2~3秒流下一滴，更慢的时候，4~5秒一滴。当然，也不要走极端，弄成7~8秒一滴，这样太慢，样品在凝胶里扩散严重，影响分离效果。上样之后，中间不要间断，一口气跑完（扩散的影响是很大的），基本上一天就能完成一个样品的。
5. 从柱子上洗脱下来的流分，在允许的范围内，接得越细越好。洗脱完毕以后可以用TLC进行检测合并（还是那句话：注意随着溶剂的挥发，看看各流分有没有结晶哈）。

Sephadex LH-20其它细节
1. 凝胶的装填要选择细长的柱子，这样分离效果才好。千万不要因为追求凝胶柱的数量，而将原本不多的填料分装成几个柱子，这样绝对得不偿失。
2. 对于一些小分子类化合物，进行Sephadex LH-20柱色谱的时候，可能死吸附会比较严重。因此在决定是否使用Sephadex LH-20的时候，要慎重。
3. 一般样品不是特别杂的时候，可以考虑使用Sephadex LH-20进行分离。对于量大的样品，如果没有足够的Sephadex LH-20填料，可以分批进行分离，也可以一次性上样完成，然后就交叉部分再进行分离。
4. 使用甲醇/水为流动相的时候，由于含水，溶剂往往不容易挥散，时间长了还可能长霉，可以考虑用旋转蒸发仪将其蒸干。
5. 流动相的置换：如果当前使用的是20%甲醇/水，下一批样品要使用氯仿/甲醇(1:1)进行作为流动相。这时候，需要先将其置换成甲醇，然后置换成氯仿/甲醇。在置换的过程中，极性变化不在太大，否则容易产生气泡。
6. 接第5点，如果是柱头部分产生气泡，用玻璃棒或者细长的铁丝就气泡搅出来就可以了；如果是柱尾部分产生气泡，可以用流动相慢慢冲出就可以了；如果是柱子中间部分，实在没办法除去，可能就面临重新的命运了。
7. 接第6点，如果在上样的过程中，由于疏忽，柱子干了怎么办？如果只干了一部分，可以及时加入流动相解救；如果全干，没办法，一般分离失败，重做吧。

Sephadex LH-20保存及污染处理
1. Sephadex LH-20可以反复再生使用，而且柱子的洗脱过程往往就是柱子的再生过程。
2. 暂时不用，可以水洗——含水醇洗（醇的浓度递增）——醇洗，最后泡在醇中贮于磨品瓶中备用。长期不用时，可以以上处理基础上，减压抽干，再用少量乙醚洗净抽干，室温充分挥散至无醚味后，60~80度干燥后保存。
3. 如果填料被污染，按书上的说法，可依次用水——NaOH-NaCl水溶液——水——甲醇冲洗柱子（NaOH-NaCl水溶液配法：8gNaOH、30gNaCl、1000ml水）。（注：上次跟实验室同学聊天，说是NaOH-NaCl水溶液可以部分溶解Sephadex LH-20填料，未曾确证，各位处理的板友麻烦帮忙留意一下，谢谢）。

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幽灵龙猫

第1楼2010/10/02

很强大
哪天用的时候出问题了，就来看攻略

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ruby70303

第2楼2010/10/02

如果使用的过程中，柱子堵了怎么办？

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第3楼2010/10/02

使用的过程中怎么会堵呢？
一般是上样的样品没处理好，然后堵的吧？
要是柱头堵了，搅一搅吧（影响分离效果）~
要是中间堵了（不太可能啊），重装吧~
ruby70303(ruby70303) 发表:如果使用的过程中，柱子堵了怎么办？

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阿宝

第4楼2010/10/02

楼主说的这个填料是不是应用在 GFC中的？不是GPC吧？
凝胶柱子很娇气

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19861005

第5楼2010/10/02

呵呵，假如堵了了，和你样品有关，，我就遇到这种情况，没办法，只有洗掉，重新上
环烯醚萜(kaikaifeng) 发表:使用的过程中怎么会堵呢？
一般是上样的样品没处理好，然后堵的吧？
要是柱头堵了，搅一搅吧（影响分离效果）~
要是中间堵了（不太可能啊），重装吧~

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19861005

第6楼2010/10/02

还有我见过用氯仿跑柱子的，效果不错，还用过丙酮撒

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19861005

第7楼2010/10/02

分离原理还有一个，吸附原理，不要忘掉这一个撒

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第8楼2010/10/02

用氯仿？填料都得浮起来~
再说了，何必单纯选用氯仿？
完全没有必要~
19861005(19861005) 发表:还有我见过用氯仿跑柱子的，效果不错，还用过丙酮撒

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第9楼2010/10/02

凝胶的吸附原理？
目前为止，我是没有听说，也没有看过相关资料~
也有可能是提得少，用它的吸附原理来分离纯化？不清楚~
可能我见识太少了吧，呵呵~
19861005(19861005) 发表:分离原理还有一个，吸附原理，不要忘掉这一个撒

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第10楼2010/10/02

第一句话，没有很看懂~
能不能详细说说？谢谢~
阿宝(lpr20) 发表:楼主说的这个填料时不时应用在 GFC中的？不是GPC吧？
凝胶柱子很娇气

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