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气相色谱-质谱法检测基围虾中的甲基汞
摘要：建立了气相色谱-质谱法（GC-MS）测定基围虾中甲基汞的方法，样品经盐酸浸提，甲苯萃取后L-半胱氨酸反萃取，NaBPh4衍生化后用正己烷萃取得到的苯化甲基汞(MeHgPh)进样。苯化甲基汞在0.05～1 g/mL的范围内线性良好。添加的三个水平浓度分别是0.05ug/kg、0.1ug/kg、0.5 ug/kg,回收率分别是109%、89.9%、102%，相对标准偏差均小于20%，检出限为0.4 ng/kg。
关键词：甲基汞；气相色谱-质谱；基围虾
Determination of Methylmercury in Shrimps Using Gas Chromatography-Mass Spectrometry
Abstract:To establish a gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS） for determination of methylmercury in Shrimps. Methylmercury has been determined after Hydrochloride digestion,extracted by toluene,back-extracted by cysteine aqueous solution,and employs a novel NaBPh4 derivatization method.Good linear were obtained ranging 0.05～1 g/mL,The evaluation of the quality of measurements was carried out by analyzing samples fortified standard solution.The concentration fortified were 0.05ug/kg,0.1 ug/kg,0.5 ug/kg.Average recoveries of methylmercury at three fortified levels were 109%，89.9%，102% respectively.The limit of detection of methylmercury was 0.4 ug/kg.
Key words: methylmercury;gas chromatography-mass spectrometry; Shrimps
近期以基围虾为代表的海产品中甲基汞的高毒性引起人们的注意，因为甲基汞的毒性是其他形态汞化合物的几十至几百倍。环境中排放的无机汞在一定条件下发生甲基化生成毒性更大的甲基汞,并通过鱼贝类从水中浓缩并富集可至数万倍,进入人体后绝大部分也被富集。在日本和伊拉克发生的群体汞中毒事件后，尽管各国对汞的排放进行了控制，但是每年还有5000万吨的排放，水产品不同程度的受到了不同程度的污染[1]。
甲基汞的分析方法应用最多的是气相色谱与电子捕获检测器(GC-ECD)。近期其他联用用技术[2]，如：将气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC) 、毛细管电泳(CE)等分离手段与原子吸收光谱(AAS) 、原子发射光谱(AES) 、原子荧光光谱(AFS) 、电感耦合等离子体质谱( ICP-MS)等具有元素选择性的检测手段相结合的方法对各种样品中的甲基汞进行测定。特别是最近应用气相色谱与质谱(GC-MS)检测海产品中的甲基汞有了很大的发展，不仅因为其低的检测限，还有质谱的定性能力。
处理海产品中的甲基汞主要有酸式消化，碱式消化，蒸馏法和微波萃取法等[3]，在这四种方法中，酸消化法得到的共提物最少，有利于后续的净化。为了改善甲基汞的挥发性和色谱性能，衍生是一个重要的步骤[4,5,6,7,8]。通常有3种衍生法方法，氢化物发生法（NaBH4），葛氏试剂衍生法（BuMgBr），直接水相衍生法（NaBEt4 或 NaBPh4），其中以NaBPh4为衍生试剂的效率更高，更适合气质方法的测定。
1 试验部分
1.1主要仪器与装置
Agilent6890N/5973 inertMSD气相色谱-质谱联用仪，带有7683自动进样器，分流/不分流进样口及EPC (电子自动控制)模式；HP-5MS (Agilent)色谱柱(30m×0. 25 mm ( i.d.)×0.25μm)熔融石英毛细管柱；分析天平；离心机；食品加工器；高速组织捣碎机；微量移液器；旋涡混和器。
1.2 主要材料与试剂
正己烷，甲苯和甲醇：色谱纯；盐酸（37%），硫酸（96%）：分析纯：L-半胱氨酸（cysteine）水溶液，四苯硼钠（NaBPh4）水溶液，硫酸铜（CuSO4）饱和液，氯化钠（NaCl）溶液均为现用现配。
用甲醇溶解适量氯化甲基汞（Methylmercury chloride）来制备标准储备液。苯化甲基汞(MeHgPh)标准工作液的制备，即取一定量的甲基汞标准储备液在PH3的条件下用四苯磞钠（NaBPh4）衍生化得到苯化甲基汞(MeHgPh)，具体步骤如下：把0.2mL0.1%四苯磞钠水溶液，0.1mL0.1%硫酸，2 mL去离子水，适量的氯化甲基汞标液和1mL正己烷依次加到10mL离心管中，振荡30min后，以4000 r/min的转速离心5min，吸取上层进样。
1.3 试验条件
1.3.1色谱条件
色谱柱：J&W HP-5石英毛细柱（30 m×0.25 mm×0.25 µm）；升温程序；150℃保持0 min，以10 ℃/min升至230℃，保持5 min，以30℃/min升至280℃，保持1 min；载气（He）流速1.0 mL/min，进样口温度250℃，进样量1µL。
1.3.2质谱条件
电子轰击（EI）离子源；电子能量70 eV；传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四级杆温度，150℃。选择离子扫描（SIM）：m/z=279,292,294
1.4样品的提取与净化
取均质好的基围虾样品1g于50ml离心管中，加入5ml 6mol/l的盐酸，超声提取30min。提取液冷却后，加入10ml10%的NaCl水溶液，涡旋3min后加入2ml甲苯，以4000 r/min的转速离心5min，转移甲苯层，再加入2ml甲苯提取，合并甲苯层，用2ml1%的半胱氨酸水溶液反萃取甲苯层后转移萃取液至10ml离心管中，其中加入1 mL 0.1%的硫酸酸化，1ml饱和的CuSO4溶液和0.2ml的NaBPh4衍生，再加入1ml正己烷萃取，然后振荡30min后，取正己烷层上机。
2 结果与讨论
2.1 衍生化试剂的选择
通常有3种衍生化方法用于将汞形态转化为相对化学惰性的形态，以更好的适应气质联用的需要。衍生的方法如前所述，这3种方法都具有简单，自发，定量进行的特点，和其他衍生化试剂相比较，NaBPh4具有价格便宜，衍生化产物稳定和自然界中不存在等优点。
为比较衍生前后的效果，本实验还对氯化甲基汞（用甲苯配制低浓度标液）在GC-MS上的灵敏度进行了探讨，在下列条件下（与本实验中的主要不同：升温程序；60℃保持1.5min，以10 ℃/min升至150℃，保持0 min，以30℃/min升至270℃，保持5 min；载气（He）流速1.5 mL/min，进样口温度210℃。选择离子扫描：m/z=202,217,237,252）进1 g/mL的氯化甲基汞1 L得到的色谱图与苯化甲基汞的相比较。
图1是基围虾样品中添加0.5 ug/g的氯化甲基汞标液反应后的苯化甲基汞的定量离子294的色谱图，图2是1 ug/ml的氯化甲基汞的定量离子252的色谱图。通过工作站求得的信噪比分别是1252和134，响应面积分别为163739和30073，显然衍生化之后的苯化甲基汞峰形更好，灵敏度更高，更适合气质联用的要求。
图1 0.5 ug/g的苯化甲基汞定量离子294的色谱图
Fig1 the chromatogram of 294 of MeHgPh
图2 1ug/ml的氯化甲基汞定量离子252的色谱图
Fig2 the chromatogram of 252 of methylmercury
2.2 方法的线性范围，回收率以及检出限
按照1.2做氯化甲基汞浓度分别是0.05,0.1,0.2,0.5,1 ug/ml的苯化甲基汞的标准曲线。方法的线性回归方程为y = 160.3x + 3197，相关系数r=0.999，线性范围为0.05～1ug/ml
在样本中添加标准溶液（0.05，0.1，0.5 ug/g三个梯度），按照1. 4节方法处理样品，重复5次，得到各不同添加水平的回收率及相对标准偏差( RSD ) (见表1)，检测限和定量限根据由添加0.05ug/g的谱图计算给出，按照3倍信噪比设定检出限，根据10倍信噪比平设定量限，信噪比都由仪器工作站给出。由表1可以看出苯化甲基汞在这三个水平上的回收率在89.9%到109%，RSD均小于20%。检出限在0.4 ug/kg。
表1 苯化甲基汞的检测限，定量限，回收率和相对标准偏差
Table1.LOD,LOQ ,recoveries of Methylmercury and RSD（n=5）
3 结论
本文研究了气相色谱-质谱法在选择离子监测模式下检测基围虾中的甲基汞残留方法。本方法在3个水平的添加回收率分别为109%，89.9%和102%，检出限是0.4ug/kg，定量限是1.3ug/kg。与传统的巯基棉吸附，苯或甲苯萃取相比较，过程更简单，干扰物少，检测限低，是检测以基围虾为代表的海产品的好方法。
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