（一）单向性流体动力学平衡理论
单向性流体动力学平衡是一种特殊的流体动力平衡，是高速逆流色谱的基础。它是Ito教授在研究旋转螺旋管组合的流体动力平衡学状态时偶然发现的。图7表示出这种单向性HDES的特点。在图中顶部画出的旋转螺旋管中包容着等量的两个互不混溶的溶剂，图中其它各处的螺旋管都画成直管，以便表明两相溶剂在整个螺旋管内的分布情况。
图7 单向性HDES的原理
在基本的HDES 中（见图 左侧），螺旋管的慢速转动使两相从首端到尾端均匀的分布，任一相的超量都会存留在螺旋管的尾端，因此，用某一相作流动相从首端向尾开始洗脱时，另一相在螺旋管里的保留量大约是柱容积的50%，这一保留量还会随流动相流速的加大而减小。由于固定相的流失，从而限制了高流速的实际应用，下面要讨论的单向性HDES就能解决上述问题。
当使螺旋管的转速加快，达到临界范围时，将产生一个不对称的离心力场，螺旋管内的两相就会沿螺旋管长度完全分开，其中一相全都占据首端的一段，我们称之为首相端。另一相全部占据尾端的一段，我们称之为尾相端。这种分布状态如图7的右侧顶端所示。这种两相的单向性分布表明如果从尾端送入首端相，它会穿过尾端相而移向螺旋管的首端；反之，如果从首端送入尾端相，它会穿过首端相而移向螺旋管的尾端。因此，可以利用这一分布的特性通过两种方式来实现逆流色谱。图7的右侧中部显示了这种正向和反向洗脱方式。这种体系还能够实现同时将两相分别从螺旋管的不同端口泵入，实现真正的逆向移动方式，如图7b底端所示。不论采用哪一种方式，都能在流动相的高流速条件下保留大量的固定相，使整个体系能在相当短的时间内实现极高的溶质色谱峰分辨度。
进一步的研究表明，这种螺旋管的高速行星式运动，使流动相恒速流过螺旋管内固定相时，在管柱任何部位的两相溶剂都以极高的频率经历着混合和沉积的过程。图8 给出了实验观察到的J型行星式运动螺旋管内两相溶剂流体动力学分布示意图。这个结果是由Conway等用频闪仪观察到的。实验采用的体系为氯仿-乙酸-水（2：2：1），为了便于观察，每一相用一定的颜色标识，首先用上相注满螺旋管柱，然后使仪器在750rpm转速下转动，并将下相从首端泵入，在建立了稳定的流体动力平衡后，用频闪仪观察到两个非常清晰的区域：靠近中心轴的将近1/4的区域（混合区），在那里两相剧烈地混合，其余的区域（沉积区），在那里两相分离成两层，重相占据螺旋管每一段的外部，轻相占据每一段的内部，并且两相沿螺旋管形成一个清晰的界面[7,8]。
图8 J型行星式运动螺旋管内两相溶剂混合区域的移动
O-公转轴心，Ob-自转轴心
所示为螺旋管在连续转动的不同位置（I，II，III，IV）时，观察到其中两相的分布情况，如图中箭头所示，螺旋管柱在以A公转的同时，再以相同的角速度在同一方向自转。图 b则表示将对应于不同的位置（I，II，III，IV）的螺旋管拉直，以更明显地表示混合区域在螺旋管内的移动，即各个混合区带都向盘绕管柱的首端行进，其行进速率和管柱的公转速率相同。因此，当流动相恒速地穿过固定相时，在管柱任何部位的两溶剂相都以极高的速率经历着混合和沉积的典型分配过程，其交替速率高于每秒13次。这个发现可以用来解释高速逆流色谱在流动相高流速的条件下实现高分配原因。
图9 IV型同步行星式运动的离心力矢量分布图
图9 所示是通过数学分析两相溶剂在螺旋管柱里离心力场的分布状态，在β>0.25的情况下，各矢量始终指向圆周的外方。给定β值时，这些矢量的绝对值和方向都对应于支持件上的位置而变化。β值加大，相对离心力矢量的绝对值也随之增大，而沿转动轴线振摆的角度幅值则会随之减小。离心力矢量的这种分布状况，对于实现逆流色谱是非常有利的。
(二) 高速逆流色谱仪器的设计
在20世纪70年代，Ito等在NIH的仪器工厂里研究和设计的多种逆流色谱，大都是以实现螺旋行星式离心分离仪（CPC）在不同支持件上所做的IV型同步行星式运动为基础的。这类螺旋行星式离心分离仪（CPC）的设计原理如图10所示。图中，仪器的轴线安排在水平位置，大直径的圆柱形螺旋管支持件同轴地装上一个行星齿轮，与装在仪器中心轴线上的固定齿轮相啮合，这两个齿轮的尺寸和形状完全一样。通过这种设计，螺旋管柱在绕仪器中心轴公转的同时，绕自身轴线作相同方向、相同角速度的自转，即实现了同步行星式的运动。仪器上的管柱用1根聚四氟乙烯（PTFE）软管在支持件上绕制而成，螺旋管两个端口并行经过一个通道引出。由于支持件的同步行星式运动，避免了螺旋管上引出的两条通道管相互打绞。多层螺旋管柱的自转半径r和公转半径R的比值β=r/R是一个影响两相互不混溶溶剂在螺旋管内分配的关键参数。
图10 实现高速逆流色谱的螺旋管行星式离心分离仪的设计原理
图 11 高速逆流色谱CPC的横截面示意图
图11给出的是基于上述设计的高速逆流色谱CPC原型的横截面示意图[1]。图12所示为美国NIH最初研制的高速逆流色谱CPC。
图12 早期高速逆流色谱CPC样机实物照片
图 13 J型多柱支持件CPC的设计
最初设计的HSCCC都是在一侧支持件上绕制螺旋管，另一侧用配重件（如图13a 所示）。后来，采用新的设计，解决了配重问题。如图13b 所示，用一个相同的螺旋管柱取代配重件，两个管柱通过连接管串联起来，流通管系的连接方式如图13b下图所示[2]。图13c 所示的是用三个或多个螺旋管柱串联的设计，由一根流通管从离心仪的一侧引入，而从另一侧引出[3]。
目前，国外使用的商品仪器多为两个螺旋管柱串联的CPC。国内目前使用的高速逆流色谱仪多为北京新技术应用研究所研制的GS10A和GS20型CPC（从1989年开始生产推广），和上海同田生物技术有限公司生产的Tauto型CPC（从2000年开始生产推广）。前者是采用一个分离柱和一个配重件的设计或两个对称分离柱的设计，后者是采用三个分离柱的设计。
根据样品的负载量和分离量，高速逆流色谱仪HSCCC可以分为分析型、半制备型和制备型。分析型HSCCC和制备型HSCCC之间没有严格的界定，通常将螺旋管柱内径≤1mm，柱体积≤50ml的称为分析型高速逆流色谱仪。HSCCC的一般色谱原理适合于分析型HSCCC。表4 所列为分析型HSCCC和制备型HSCCC的仪器参数和操作参数的比较。
4 分析型和制备型HSCCC的仪器参数和操作参数的比较
项目
|
分析型
|
制备型
|
仪器
|
J型多层螺旋管离心分离仪
|
J型多层螺旋管离心分离仪
|
螺旋管柱内径（mm）
|
<1
|
>1,到3~4
|
柱体积（ml）
|
15~50
|
50~1000
|
流速（ml/min）
|
0.1~1
|
2.0~10
|
转速（r/min）
|
1500~3000
|
<1000
|
样品量
|
1µg~10mg
|
10mg~10g
|
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