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【第三届原创大赛】由测试DNA样品而引发的思考

紫外可见分光光度计(UV)

  • 近日,修理一台紫外可见分光光度计,感觉颇有意思,特记录下来与诸君分享。
    障:
    使用者反映,在测试DNA样品时,其测试值重现性不良。故怀疑是仪器的故障。
    查:
    1)仪器为双光束分光光度计,采用多波长的测量方式,分别设定为280nm260nm二个DNA的特征波长。样品比色皿采用了微量比色皿(50微升),如下图-1


    图-1 微量比色皿

    2DNA样品采用固定一个,为的是保证测试结果的同一性。
    3)仪器预热并用空气调零后开始测DNA样品,步骤是:测完一次后将样品从样品室中取出,间隔几十秒钟后再次放入仪器中测试;这样周而复始地连续测量十余次,结果测量的吸光值的确呈逐渐变大的趋势。
    4)为了证实仪器是否有问题,参比一侧以空气做空白;在测量样品的间隔中,测量空白(空气)值,以观察仪器是否漂移。其结果见附图-2


    图-2 测量结果

    5)从测试结果看,WL1WL2的零点分别在0.000~0.004Abs0.010~0.014Abs间变化;
    WL1WL2的测试值却呈现逐渐走高的趋势,分别为0.279~0.432Abs0.359~0.511Abs

    结 论:仪器没有问题,而是DNA样品本身的问题。

    思 考:
    (1)DNA样品的这种走高现象我以前也遇到过,曾考虑是样品遭到氧化的原因。
    (2) 这次我的推论是:DNA样品极易形成分子团并吸附在比色池的池壁上,随着时间的推移,吸附在池壁上的DNA越来越厚,吸光值自然也就逐渐加大了。
    (3)因此,如何解决快速测量及添加稳定剂就是一个很好的研究课题。
    (4)这种现象也会发生在原子吸收上,尤其是采用石墨炉测试Pb时,同一个样品杯里的样品上午和下午的测试结果相差很大,关于这点许多专著上均有解释,那就是:铅的样品极易被吸附在样品杯壁上,于是进样器吸取的样品浓度会逐渐变低,自然其测试值随之逐渐减少了,这也就是为何原吸样品中添加硝酸的原因了。但是这种在比色方法中的吸附影响,不知有无专著解释过?

    后 记:
    虽然文章仅有寥寥五百来字,但我认为其内容可能还算是值得借鉴的吧?仁者见仁智者见智,欢迎大家拍砖。
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  • 祥子

    第1楼2010/11/24

    看来,anping老师判断仪器的稳定性,是看空白值的稳定性。

    恩,学习了。

    anping老师,你这个仪器是什么型号呢?

    因为,我前修的那个UV765,吸光度值显示0.0000Abs。小数点后4位。

    透过率可以显示100.00%,也是小数点后2位。

    UV765的双光路,有点特殊,晚上我另开一贴,您看看。虽然UV765是双光束,不过出狭缝时(单色器内部),光被分为两路。在样品室中,只能看到一个光束。
    这种情况多见吗?毕竟,我见双光束仪器见的少。

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  • 夕阳

    第2楼2010/11/24

    应助达人

    我检修的仪器是U-2800型的。小数点也可设到0.0000Abs,但是到了小数点的后四位,我认为没有身边么意义了。您看呢?
    这种情况是指测DNA的变化吗?

    祥子(nemoium) 发表:看来,anping老师判断仪器的稳定性,是看空白值的稳定性。

    恩,学习了。

    anping老师,你这个仪器是什么型号呢?

    因为,我前修的那个UV765,吸光度值显示0.0000Abs。小数点后4位。

    透过率可以显示100.00%,也是小数点后2位。

    UV765的双光路,有点特殊,晚上我另开一贴,您看看。虽然UV765是双光束,不过出狭缝时(单色器内部),光被分为两路。在样品室中,只能看到一个光束。
    这种情况多见吗?毕竟,我见双光束仪器见的少。

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  • 祥子

    第3楼2010/11/24

    不是,是说这种双光路这样布局的情况。

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  • 夕阳

    第4楼2010/11/24

    应助达人

    奥,明白了,你说的就是那种所谓的“准双光束”一类的仪器。机内那束参比光仅作为防止灯漂移而设计的参照信号。
    对扣除样品中的背景是无能为力的,说穿了,本质上还是单光束的仪器。这类仪器以国产仪器居多。

    祥子(nemoium) 发表:不是,是说这种双光路这样布局的情况。

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  • jelly98

    第5楼2010/11/24

    分析的不错,据我所知DNA样品稳定性较差。

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  • 初学者&九点虎

    第6楼2010/11/24

    安老师提高说DNA暴露在空气中氧化,我们做酶学实验的时候,加完样品后用封口膜把比色皿上表面糊起来,是否能在一定程度上起到隔绝空气的作用。

    但也有一个问题,液面和封口膜之间还是有空气存在的,如果更严格的话,是否可以考虑稍微氮吹一下,再加封口膜

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  • tutm

    第7楼2010/11/25

    这个情况应该不是溶质分子在比色皿壁上吸附造成的。

    因为如果溶质分子在内壁吸附,会降低溶液浓度,但在光通过的两面壁上吸附的分子仍然会吸收光线能量,应该影响不大;但是在侧面壁上吸附,它对吸光度没有贡献了。因此,综合起来的结果应该是吸光度逐步下降才合理。

    这个现象正好做动力学测试,说不定他们还可以有新发现啦。

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  • tutm

    第8楼2010/11/25

    这种现象也许与溶质分子的磷光特性有关,不知道他们用荧光光度计测过没有,如果样品有较长时间磷光现象的话,就可以有合适的解释了。

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  • rigmarole

    第9楼2010/11/25

    我们现在的UV检测核酸遇到的情况刚刚相反,随着时间的增加读数渐渐降低
    开始时用去离子水做空白的,发现检测一段时间后再测水的OD值也降低了,估计是基线漂移造成的,改天学习安老师的方法观察仪器是否漂移

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  • xiadaquan

    第10楼2010/11/25

    学习一下 其实的方法很值得学习

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