RP-HPLC测定丹参通脉颗粒中丹酚酸B的含量
目的：建立一种高效液相色谱法测定丹参通脉颗粒中丹酚酸B的含量的方法。方法：色谱柱 Kromasil C18 4.6×250mm 5μm，流动相为甲醇-乙腈-甲酸-水 (30：10：1：59)，检测波长286nm，流速0.8ml.min-1。柱温30℃。结果: 丹酚酸B在9.2μg·mL-1（0.0184μg）―184μg·mL-1（0.368μg）范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系,相关系数r = 0.9995；丹酚酸B的回收率为100.46%，相对标准偏差RSD=1.87%,丹参通脉颗粒中丹酚酸B的含量为210.99mg.g-1, RSD=1.03% 。 结论：本法灵敏、准确、专属性强、重现性好，可作为丹参通脉颗粒剂中丹酚酸B的含量测定方法。
关键词：丹参通脉颗粒；丹酚酸B；HPLC； 含量测定
Determination the content of tanshinoate B in Danshentongmai granules by HPLC method
ABSTRACT： Objective:To establish a reversed-phase HPLC method for the determination of tanshinoate B in Danshentongmai granules.Method: A Kromasil C18 charomatographic column (4.6×250mm, 5μm) served as the solid phase; methol-acetonitrile-formic acid-water(30:10:1:59) was at 30℃; the flow rate,0.8mL/min;UV detection wavelength,286nm. Results:There was a good linear relationship over a rang of 9.2μg.mL-1～184μg.mL-1 for tanshinoate B (r= 0.9995).The average rates of recovery of aristolochic tanshinoate B was 100.46%;the RSD was 1.87%;the content of tanshinoate B in Danshentongmai granules was 210.99μg.g-1 .Conclusion:This method is sensitive,accurate,reproducible and can be used as Danshentongmai granules tanshinoate B method for the determination.
Key words:Danshentongmai granules;tanshinoate B;Determination; HPLC
前言
丹参通脉颗粒剂主要是由丹参、当归、决明子、川芎、红花、赤芍等中药组成，具有养血活血、疏风通络，临床上主要用于预防和治疗各种疾病引起的眼底出血。丹参为丹参通脉颗粒剂中的主要有效成分之一，其主要化学成分有脂溶性的丹参酮类化合物和水溶性的酚酸类化合物[1-3],。其中,主要水溶性成分丹酚酸B (salvianolic acid B)为三分子丹参素与一分子咖啡酸缩合而成,据报道,丹酚酸B有强烈的抗氧化和清除氧自由基的活性,其抗脂质过氧化作用约为维生素E的1000倍,对肾功能不全和肝损伤均有一定保护作用。由于对丹参水溶性成分研究起步较晚,有关丹酚酸B含量测定的报道并不多见[4-6].除丹酚酸B外,水溶性酚酸类还包括丹酚酸A、丹酚酸C、迷迭香酸、丹参素、原儿茶醛等,其中丹酚酸B是质量分数最高的活性成分,因此本实验用HPLC法对丹参通脉颗粒剂中所含丹酚酸B进行测定,以提高其标准,用于该制剂的质量控制。
材料与方法
1 材料
1.1 仪器：
美国SSI高效液相色谱仪(高压四元泵，双波长检测器，LabAlliance HPLC Workstation)。电子天平(1/10万，赛多利斯科学仪器北京有限公司)。KQ-250E超声波清洗机(昆山超声仪器有限公司)。真空泵(广东海利集团)。SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)。SZ-97A自动三重水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。连续式移液器(美国热电仪器有限公司)。102-3远红外快速干燥箱(北京兴争仪器设备厂)。
1.2 试剂
丹酚酸B标准品(中国药品生物制品检定所提供，批号110766-200416)。丹参通脉颗粒剂(河北省张家口市眼科医院提供,批号为070830 、070831 、070832)。三重蒸馏水自制。甲醇、乙腈为美国进口色谱纯，其它试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 色谱条件
美国SSI高效液相色谱仪, Kromasil C18色谱柱(4.6×250mm 5μm)，紫外检测器。流动相为乙腈:甲醇:甲酸:水 (10：30：1：59)，检测波长286nm，流速0.8ml.min-1。柱温30℃。
2.2 溶液的制备
2.2.1 丹酚酸B标准液的配制
精密称取4.60mg丹酚酸B于5.00ml容量瓶中，加甲醇稀释到刻度，摇匀。得920μg.mL -1的丹酚酸B标准液,备用。
2.2.2 样品溶液的制备
精密称取丹参通脉颗粒剂1.891g研细成粉，置25mL量瓶中。加入甲醇约20mL，超声处理30min使溶解，放冷至室温，加甲醇至刻度摇匀即得样品溶液，进样前用0.45μm滤膜滤过。
2.2.3 阴性对照品溶液制备
按本制剂的处方、工艺制成缺丹参的空白样品，按上述样品溶液的制备方法处理即得阴性对照液，进样前用0.45μm滤膜滤过。
2.3 线性关系考察
精密吸取0.1,0.2,0.4,0.8,1.0,2.0 ml于6个10.00ml容量瓶中，加甲醇定容，即得对照品溶液，用0.45μm微孔滤膜过滤，分别精密吸取20μl进样,按上述条件测定峰面积。
2.4 精密度试验
用丹酚酸B对照品溶液重复进样5次，每次20μL，分别测定峰面积。.
2.5 重现性试验
精密称取丹参通脉颗粒剂3份，按本文方法处理和测定，每份进样3次，每次进样20μL，分别测定峰面积。
2.6 稳定性试验
取样品溶液，分别于1、2、6、10、24、72h进样，每次20μL，分别测定峰面积。
2.7 回收率实验
取样品溶液20μL注入高效液相色谱仪，测得含量为19.80μg.mL -1 ，取9份上述溶液每份1 ml，向其中加入高,中,低量丹酚酸B的对照品各3份，分别测定峰面积。
2.8 样品含量测定
取三个不同批号的丹参通脉颗粒剂按样品溶液制备方法制备供试品溶液，进样前用0.45μm滤膜滤过，分别进样，进样量为20μL，分别测定峰面积。
结果
1 色谱系统适用性
在以上色谱条件下检测，丹酚酸B的保留时间为24.7min，以丹酚酸B计算理论塔板数为3435，分离度为2.953。对照品、阴性对照品及丹参通脉颗粒剂样品色谱图见图1～图3。
2 线性关系考察
以对照品20μl中所含药物的μg数为横坐标，峰面积积分值（uV.s）为纵坐标，进行线性回归，求得回归方程y = 3842032.5218x + 8590.7732、r = 0.9995。结果表明，丹酚酸B的浓度在9.2μg·mL-1（0.0184μg）―184μg·mL-1（0.368μg）与峰面积有良好的线性关系。见图4
3 精密度实验
依照“2.4”项下方法分别测定峰面积，计算丹酚酸B的含量得测定结果的RSD=0.99%,表明该方法有较好的精密度。见表1
4 重复性实验
按照“2.５”项下方法分别测定峰面积，计算得测定结果的RSD=0.78%,说明本法的重复性较好。见表2.
5 稳定性实验
按照“2.６”项下方法分别测定峰面积计算得丹酚酸B的RSD=1.5%。说明丹酚酸B在72h内稳定性好。见表3.
6 回收率实验
按照“2.７”项下方法分别测定峰面积，计算回收率，得平均回收率为100.46% ，RSD= 1.87%，见表4.
7 样品的含量测定
按照“2.８”项下方法分别测定峰面积，得丹参通脉颗粒剂中丹参酮ⅡA的平均含量为210.99μg·g-1，RSD=1.03%(n=3)，见表5。
讨论
1 曾采用水、甲醇、75%甲醇为提取溶媒,制备供试品溶液,测定丹参通脉颗粒中丹酚酸B的质量分数,结果以本实验提取溶媒甲醇为佳。
2 丹酚酸B是药理作用明确而且在丹参药材中的量较高的成分,《中国药典》2005年版规定丹参药材中丹酚酸B不低于3%,因此以丹酚酸B为指标可有效地控制制剂质量。由于丹酚酸B受热时不稳定,因此在样品制备方法上选择甲醇超声提取。且为保证提取完全,确立超声处理时间为30 min。
3 色谱条件的选择 国家药监局制订的丹参片质量标准修订草案提供的色谱条件中,色谱柱选用EMCC柱(十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂),我结合本课题组实际情况,改用Kromasil C18色谱柱(4.6×250mm 5μm)。流动相曾选择甲醇：水：冰醋酸(46：54：0.5,含6 mmoL.L-1的四丁基溴化胺)、甲醇：水(用甲醇调pH=2.5)(41.5：58.5)、甲醇：5%乙酸(35：65),分离效果均不理想,后改用乙腈:甲醇:甲酸:水 (10：30：1：59)为流动相,结果分离效果好,样品中主峰与杂峰分离度>1.5,理论塔板数>2 000。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中国药典(2005年版一部).北京:化学工业出版社,2005.52.
[2] 游勇基,陈铭辉.高效液相色谱法测定丹参中丹酚酸B等3种有效成分[J].中国药学杂志,2003,38(12):950-952.
[3] 杨广德,贺浪冲,李永茂.丹参有效部位指纹图谱定性和有效成分定量分析方法研究[J].药物分析杂志,2003,23(6):409-413.
[4] 吕东,刘亚蓉.复方丹参胶囊质量控制标准研究[J].西北药学杂志,2000,15(6):254.
[5] 洪馨,王宁生.高效液相色谱法测定复方丹参滴丸中丹参素和丹参酮ⅡA的含量[J].中药新药与临床药理，2002,13(4):247-249.
[6] 张翠莲,张伟琪,杨秀斌,等.复方丹参注射液的质量考察[J].中国药学杂志,2003,38(1):56-58.
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