【讨论】生物技术常用实验操作简单介绍

四、大肠杆菌质粒DNA的提取（碱裂解法）

此方法适用于小量质粒DNA的提取提取的质粒DNA可直接用于酶切PCR扩增。

1. 取1.5ml细菌培养物于EP管中，4000rpm离心1分钟，弃上清液，使细菌沉淀尽量干燥；

2. 将细菌沉淀重悬于用冰预冷的100 μl溶液I (50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中，剧烈振荡；

3. 加入200 μl新配制的溶液II(0.2 mol/L NaOH，1％SDS（m/v）)，盖紧EP管口，快速颠倒离心管5次，以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液II接触，不要涡旋，置于冰浴中；

4. 加入150 μl预冷溶液III(每100 ml 的溶液III中含60 ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml冰乙酸，28.5 ml H2O)，盖紧EP管口，反复颠倒数次，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3~5分钟；

5. 在最大转速下离心5min，取上清液于另一新EP管；

6. 用两倍体积的乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合于室温放置2分钟，最大转速离心5分钟；

7. 小心吸去上清液，将离心管倒置于滤纸上，以使所有液体都流出，在将附于管壁的液滴除尽；

8. 加1ml 70％乙醇洗涤沉淀，振荡混合，用12,000g离心2分钟，弃上清，将开口的EP管置于室温使乙醇挥发，直至EP管中内没有可见的液体存在（5～10分钟），用适量的ddH2O溶解；

9. 用0.5μl的RNase 37℃温育5~10分钟；

10. 电泳鉴定。

五、感受态细胞的制备

1. 挑取适当菌株的E.coli 单菌落接种于2ml SOB培养液中，37℃摇床过夜。

2. 取0.5-1ml过夜培养的菌液转种到50ml SOB中，18℃剧烈震荡，直到A600达到0.6。

3. 将培养物转移到50ml离心管中，4℃ 4,000rpm/min离心10min。同时在冰浴上配置TB溶液。

4. 弃上清，将离心管倒置于滤纸上，使培养液被吸干。

5. 取1ml刚配的TB溶液打散菌体沉淀，再加入15ml TB（1/3体积的起始培养液），冰浴10-15min，4℃ 4,000rpm/min离心10min。

6. 弃上清，沉淀重悬于4ml TB（1/12.5体积的起始培养液），冰浴10min。

7. 加入280μl DMSO，缓缓滴入并轻轻摇晃，使其充分混合均匀，冰浴10min。

8. 将菌液分装于EP管中，-80℃或液氮冻存。

9. 取两管感受态细胞分别加入1μl无菌ddH2O（阴性对照）和1μl纯质粒（阳性对照）进行转化（见后），以检测感受态的质量。阴性对照平板上应该无菌落生长，阳性对照平板上菌落数目的多少显示感受态效率的高低。

六、SOB的配制：

蛋白胨 20g

酵母提取物 5g

NaCl 0.58g

KCl 0.186g

100×Mg++溶液 10ml

溶解并加水定容至1L，121℃×20min高压蒸汽灭菌

100×Mg++溶液：

MgCl2﹒6H2O

MgSO4﹒7H2O

溶解并加水定容至100ml，121℃×20min高压蒸汽灭菌

TB溶液的配制：

1M KCl 5ml

0.55M MnCl2 2ml

0.5M CaCl2 0.6ml

0.1M K-Pipes(pH 6.7) 2ml

ddH2O 10.4ml

Total 20ml

注：上述溶液均需高压蒸汽灭菌处理

0.1M K-Pipes(pH=6.7)的配制：

称取3.02g Pipes粉末溶于80ml dd H2O中，此时粉末不能完全溶解，用10N KOH或KOH固体调节PH值，只有当PH接近6.7时粉末才能完全溶解，此时当小心少量地加入KOH直至达到所需PH值。

七、转 化

1. 取100μl感受态细胞于冰浴上融化。

2. 加入1μl纯质粒或连接产物，轻轻吹打混匀，冰浴30 min。

3. 将菌液放入42℃水浴中热激90秒，立即放入冰浴中2 min。

4. 加入0.9ml SOC，于37℃恒温摇床上200rpm×1hr温育。

5. 将菌液4000rpm/min离心3min，留200μl上清将菌体打散，均匀涂布于含适当抗生素的琼脂平板表面，平板于37℃倒置培养过夜。

i. 注：新倒的平板可于37℃培养箱中预先放置数小时至过夜干燥。

ii. 当转化的是TA克隆连接产物时可在菌液中加入8μl 1M IPTG和40μl 20mg/ml X-gal以进行蓝白斑筛选。

楼主对SDS电泳熟悉不?有时间向你学习下