实验室常用技术参数——常用缓冲液

省部重点实验室

2012/11/27

私聊

生命科学仪器综合讨论

常用缓冲液

　　1．分子克隆常用缓冲液

　　2．磷酸缓冲液

　　（1）25℃下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制^※

pH	1mol/L K₂HPO₄(ml)	1mol/L KH₂PO₄(ml)
5.8	8.5	91.5
6.0	13.2	86.8
6.2	19.2	80.8
6.4	27.8	72.2
6.6	38.1	61.9
6.8	49.7	50.3
7.0	61.5	38.5
7.2	71.7	28.3
7.4	80.2	19.8
7.6	86.6	13.4
7.8	90.8	9.2
8.0	94.0	6.2

　　（2）25℃下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制^※

pH	1mol/L Na₂HPO₄(ml)	1mol/L NaH₂PO₄(ml)
5.8	7.9	92.1
6.0	12.0	88.0
6.2	17.8	82.2
6.4	25.5	74.5
6.6	35.2	64.8
6.8	46.3	53.7
7.0	57.7	42.3
7.2	68.4	31.6
7.4	77.4	22.6
7.6	84.5	15.5
7.8	89.6	10.4
8.0	93.2	6.8

　　※:用蒸馏水将混合的两种1mol/L贮存液稀释至1000ml，根据Henderson-Hasselbalch方程计算其pH值：

　　pH=pK’+1g([质子受体]/[质子供体])

　　在此，pK’=6.86(25℃)。

　　3．电泳缓冲液

　　测序凝胶加样缓冲液

　　98%去离子甲酰胺

　　10mol/L EDTA(pH8.0)

　　0.025%二甲苯青FF

　　0.025%溴酚蓝

　　甲酰胺：许多批号的试剂级甲酰胺，其纯度符合使用要求，无须再进行处理。不过，一旦略呈黄色，则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与Dowex XG₈混合床树脂共同搅拌1小时进行去离子处理，并用Whatman 1号滤纸过滤2次，去离子甲酰胺分装成小份，充氮存于-70℃。

常用的电泳缓冲液

缓冲液	使用液	浓贮存液（每升）
Tris-乙酸（TAE）	1×：0.04mol/L Tris-乙酸	50×：242g Tris碱
	0.001mol/L EDTA	57.1ml冰乙酸
		100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
Tris-磷酸（TPE）	1×:0.09mol/L Tris-磷酸	10×:10g Tris碱
	0.002mol/L EDTA	15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）
		40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
Tris-硼酸（TBE）^a	0.5×0.045mol/L Tris-硼酸	5×：54g Tris碱
	0.001mol/L EDTA	27.5硼酸
		20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
碱性缓冲液^b	1×:50mmol/L NaOH	1×:5ml 10mol/L NaOH
	1mmol/L EDTA	2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)
Tris-甘氨酸^c	1×:25mmol/L Tris	5×:15.1g Tris
	250mmol/L 甘氨酸	94g 苷氨酸（电泳级）（pH8.3）
	0.1% SDS	50ml 10% SDS(电泳级)

　　说明：

　　①TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液，出现沉淀后则予以废弃。

　　以片都以1×TBE作为使用液（即1：5稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以1：10稀释的贮存液作为使用液。

　　进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小，故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。

　　②碱性电泳缓冲液应现用现配。

　　③Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

　　2×SDS凝胶加样缓冲液：

　　100mmol/L Tris·HCl(6.8)

　　200mmol/L二硫苏糖醇（DTT）

　　4%SDS（电泳级）

　　0.2%溴酚蓝

　　20%甘油

　　不含DTT的2×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取1mol/L贮存液现加于上述缓冲液中。

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第1楼2012/11/27

4．凝胶加样缓冲液

缓冲液类型	6×缓冲液	贮存温度
Ⅰ	0.25%溴酚蓝	4℃
	0.25%二甲苯青FF
	40%（W/V）蔗糖水溶液
Ⅱ	0.25溴酚蓝	室温
	0.25%二甲苯青FF
	15%聚蔗糖(Ficoll400)
Ⅲ	0.25%溴酚蓝	4℃
	0.25%二甲苯青FF
	30%甘油水溶液
Ⅳ	0.25%溴酚蓝	4℃
	40%(W/V)蔗糖水溶液
	碱性加样缓冲液:
	300mmol/L NaOH
	6mmol/L EDTA
Ⅴ	18%聚蔗糖(Ficoll400)	4℃
	0.15%溴甲酚绿
	0.25%二甲苯青FF

　　使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBF作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5%～1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。

　　选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。

　　5．各种pH值的Tris缓冲液的配制

各种pH值的Tris缓冲液的配制
所需pH值（25℃）	0.1mol/L HCl的体积
7．1	45．7
7．2	44．7
7．3	43．4
7．4	42．0
7．5	40．3
7．6	38．5
7．7	36．6
7．8	34．5
7．9	32．0
8．0	29．2
8.1	26.2
8.2	22.9
8.3	19.9
8.4	17.2
8.5	14.7
8.6	12.4
8.7	10.3
8.8	8.5
8.9	7.0

　　某一特定pH值的0.05mol/L Tris缓冲液的配制：将50ml 0.1mol/L Tris碱溶液与上表所示相应体积（单位：ml）的0.1ml/L HCl混合，加水将体积调至100ml

　　（2）温度对50mmol/L Tris·HCl液pH值的影响

4℃	25℃	37℃
8．1	7．5	7．2
8．2	7．6	7．3
8．3	7．7	7．4
8．4	7．8	7．5
8．5	7．9	7．6
8．6	8．0	7．7
8．7	8．1	7．8
8．8	8．2	7．9
8．9	8．3	8．0
9．0	8．4	8．1
9．1	8．5	8．2
9．2	8．6	8．3
9．3	8．7	8．4
9．4	8．8	8．5

　　（6）常用缓冲液的pKa值

缓冲液	分子量	pKa值	缓冲范围
Tris^a	12.1	8.08	7.1～7.9
HEPES^b	283.3	7.47	7.2～8.2
MPOS^c	209.3	7.15	6.6～7.8
PIPES^d	304.3	6.76	6.2～7.3
MES^e	195.2	6.09	5.4～6.8

　　a：三羟甲基氨基甲烷；b：N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磷酸；c：3-（N-吗啉代）丙磺酸；d：N，N’-双（2-乙磺酸）哌嗪；e：2-（N-吗啉代）乙磺酸。

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第2楼2012/11/27

7．温度对常用缓冲液pH的影响

缓冲体系	pKa(20℃)	△pKa/10℃
Mes	6.15	-0.110
Ada	6.60	-0.110
PiPes	6.80	-0.085
Aces	6.90	-0.200
Bes	7.15	-0.160
Mops	7.20	-0.013
Tes	7.50	-0.200
Hepes	7.55	-0.014
Tricine	8.15	-0.210
Tris	8.30	-0.310
Bicine	8.35	-0.180
Glycylglycine	8.40	-0.280