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【第三届原创参赛】啤酒酵母细胞自溶技术破壁研究

省部重点实验室

2010/12/05

私聊

生命科学仪器综合讨论

维权声明：本文为gl19860312原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。本实验室主要工作就是:微生物发酵与代谢调控、蛋白的分离纯化、生物材料的研发与生产（化妆品、面膜、人工血管、人工骨................)

啤酒酵母细胞自溶技术破壁研究

摘要：研究了PH、温度、食盐浓度三个因素对啤酒酵母细胞破壁的影响，确定出最佳的自溶法破壁条件。进而为分离啤酒废酵母中的有效活性成分奠定了基础。

关键词：啤酒酵母；破壁；自溶

The Research of Autolysis on the Beer Yeast Cells wall

Abstract：This paper researched the condition of autolysis on the waste yeast cells wall with three factors (pH 、Temperature 、Salt density) and determined the best condition based on autolysis. And build basis for separating the activity forms from beer waste yeasts.

Key words: The beer yeast; Breaking Cells wall; Autolysis

引言

啤酒酵母（S.csrsviside）属于真菌门酵母属，多数为单细胞微生物，细胞呈圆形或卵圆形，革兰氏染色呈阳性G+。啤酒酵母细胞是由细胞壁、细胞膜、液泡、颗粒和线粒体等部分组成，细胞年幼的时候细胞壁很薄，所以不明显；细胞年老时，细胞壁较厚。

啤酒酵母细胞内不但含有丰富的蛋白质、维生素、葡聚糖及甘露聚糖等营养及保健成分，可作为食用单细胞蛋白，此外还含有辅酶I、细胞色素,卵磷脂、RNA,，这些物质或其降解产物及衍生物如氨基酸制剂和核苷酸及核酸制剂等在生物化学、医药及保健食品中最有重要的作用。由于啤酒废酵母价格便宜，因此可利用啤酒废酵母来提取、制备这些物质。

啤酒废酵母(waste brewer's yeast)是啤酒生产的副产物，是指啤酒酿造后沉降的酵母泥，主要是由大量的弱细胞和死细胞组成。在啤酒生产过程中，每生产 100吨啤酒大约有1-1.5吨废酵母 (以干重计)产生。传统的处理方法，是弃置不用或作为饲料处理，直接排放到河流湖泊中，将造成环境污染，同时也是对财富的浪费；因其具有坚韧的细胞壁和特有的酵母臭，适口性差，不易消化和吸收，故烘干作为饲料用的经济效益不高。充分利用啤酒废酵母可以有效地减轻污染，实现资源的二次转化，也可产生巨大的经济效益，如开发酵母抽提物。

为了增加酵母抽提物产量国内外同行做出不同努力，开展了有些研究。目前关于啤酒酵母破壁的研究很多，大体可归纳为：化学破壁(酸解、碱解)、物理破壁(液体剪切、固体剪切等)、生物破壁(酶解、自溶)。其中，化学破壁不仅会造成一些营养成分的破坏，而且为有效成分的提取增加困难；物理破壁虽然方法简单、成本低，能完好保存营养成分，但其破壁效果较差；生物破壁中的酶解法会增加提取成本，故均不能大规模广泛的应用。而采用自溶法进行细胞破壁是一种简便易行的操作过程，通过确定啤酒酵母细胞最适合的自溶条件，可以建立一套利用酵母细胞生产酵母抽提物的工艺和方法，旨在为啤酒酵母的综合利用寻求一种新的方法，为工业化生产提供理论基础和实践指导。

1．4实验方法

工艺流程

啤酒废酵母（保藏）—— 活化、两次斜面培养—— 接种、平板划线——摇瓶培养——取对数期的酵母细胞——做稀释梯度——做影响因素（温度、食盐浓度、pH并固定时间60分钟）的实验-——做正交试验——镜检（血球计数法）——计算啤酒酵母细胞的破碎率——得到自溶的最佳工艺参数

1．5啤酒废酵母自溶条件的确定

酵母自溶的实质是酵母细胞内的蛋白质在自身蛋白酶的作用下，降解为游离的氨基酸，那么，一切影响酶促反应的因素均影响酵母细胞的自溶，如自溶温度、食盐浓度、pH值、自溶时间等。自溶法是以存在酶活性的新鲜活酵母为原料，利用酵母细胞本身的酶系，在一定条件下，将酵母体内的糖类物质、蛋白质和核酸分解为还原糖、氨基酸、肤类、核昔酸等小分子物质并从酵母细胞内抽提出来的一种方法。利用自溶法生产的酵母抽提物，蛋白质分解率高，游离氨基酸含量高，风味好，成本较低，但呈味核昔酸含量低.目前，欧美及我国所生产的酵母抽提物绝大部分都是采用这种方法。

1．5．1 pH对啤酒酵母自溶的影响

取相同浓度的啤酒酵母悬浮液（对数期），分别调pH 4.0 , 4.5, 5.0, 5.5, 6.0，在最适温度28℃培养一个小时，做稀释梯度，染色镜鉴，确定适宜的起始pH值。在自溶温度、自溶时间、食盐浓度一定的情况下，起始pH5.0时，酵母细胞破碎率最高，故pH5.0为最适自溶pH值。

pH对啤酒醉母自溶的影响见表

Effect of pH on yeast autolysis

pH 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
破碎率 33% 36% 40% 34% 32%

1．5．2食盐浓度对啤酒酵母自溶的影响

附件：

啤酒酵母细胞自溶技术破壁研究.pdf

精
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私聊

titi

第1楼2010/12/06

楼主作品不完整啊！！期待继续补充和完善
在完成之前暂时不收录在参赛作品列表中！由于是最后一个月参赛了~~所以楼主一定要在月末之前补充完整哦~

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私聊

省部重点实验室

第2楼2010/12/06

1．3 测定方法

pH值的测定： pHS-3C型酸度计法、pH精密试纸

酵母细胞破碎度的测定：血球计数板法

其中：细胞破碎效果的评价，主要以细胞破碎率来定量表征。这对于破碎工艺的选择、工艺放大和工艺条件的优化等有非常重要的作用。（破碎后，破碎过程所释放的物质，如DNA和其他聚合物组分会干扰计数，此时可采用染色的方法把破碎的细胞与未受损害的完整的细胞区分开来。如：采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，未受损害的细胞为紫色，而受损害的细胞呈亮红色。）细胞破碎率定义为破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比。

即： S==(No—Ni)/No*100%

S ——破碎率；

No——原始细胞数量；

Ni——经时间t操作以后保留下来的为受损害的完整细胞数量

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私聊

省部重点实验室

第3楼2010/12/06

1．5．2食盐浓度对啤酒酵母自溶的影响

取相同浓度的啤酒酵母悬浮液（对数期），分别加入1%, 2%, 3%, 4% (w/w)的食盐，在28℃下培养一个小时后，做稀释梯度，染色镜鉴。得出：随着食盐浓度的增大，酵母细胞破碎率不断的增大；在食盐浓度为3%时，细胞破碎率达到最大；在试验中还发现当不添加食盐时，自溶液在32h—36h使出现腐败现象，说明食盐有防腐作用。

食盐浓度对啤酒酵母自溶的影响见表

Effect of salt density on yeast autolysis

食盐浓度	1%	2%	3%	4%
破碎率	32%	36%	39%	38%

1．5．3 温度对啤酒酵母自溶的影响

取相同浓度的啤酒酵母悬浮液（对数期），分别在40℃ ,45℃, 50℃, 55℃温度下培养一个小时后，做稀释梯度，染色镜鉴，确定适宜的作用温度。在40℃—55℃温度范围内，温度为50℃的时候酵母破碎率达到最大，故50℃为最佳自溶温度。

温度对啤酒酵母自溶的影响如图

Effect of temperature on yeast autolysis

温度（℃）	40	45	50	55
破碎率	27%	33%	35%	34%

1．5．4最佳自溶条件的正交试验

根据单因素试验，初步确定了啤酒酵母在单因素影响实验条件下自溶条件:自溶温度50℃，自溶pH5.0,自溶促进剂食盐的浓度3%(w/w)。在此基础上进一步正交实验，采用正交实验对以上影响因素进行探讨，以啤酒酵母的破碎率为指标，确定啤酒酵母自溶的最佳条件。试验因素和水平见表:

啤酒酵母自溶条件正交试验因子水平表

Levels of factors for yeast autolysis

处理号	温度	pH	食盐浓度	破碎率
1	45	4.5	1%	72%
2	45	5.0	2%	69%
3	45	5.5	3%	70%
4	50	4.5	2%	78%
5	50	5.0	3%	76%
6	50	5.5	1%	80%
7	55	4.5	3%	74%
8	55	5.0	1%	78%
9	55	5.5	2%	75%

1．5．5对正交试验进行极差方法分析与推论

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私聊

省部重点实验室

第4楼2010/12/06

1．5．5对正交试验进行极差方法分析与推论

L₄（2³）正交试验计算

处理号	1	2	3	试验指标y_i
1	1	1	1	y1_=72%
2	1	2	2	y₂_=69%
3	1	3	3	y₃_=70%
4	2	1	2	y₄_=78%
5	2	2	3	y₅_=76%
6	2	3	1	y₆_=80%
7	3	1	3	y₇_=74%
8	3	2	2	y₈_=78%
n=9	3	3	1	y₉_=75%
Ⅰ_j	Ⅰ₁＝y₁＋y₂＋y₃＝211%	Ⅰ₂＝y₁＋y₄＋y₇＝224%	Ⅰ₃＝y₁＋y₆＋y₈＝230%
Ⅱ_j	Ⅱ₁＝y₄＋y₅＋y₆＝234%	Ⅱ₂＝y₂＋y₅＋y₈＝223%	Ⅱ₃＝y₂＋y₄＋y₉＝222%
Ⅲj	Ⅲ₁＝y₇＋y₈＋y₉＝227%	Ⅲ₂＝y₃＋y₆＋y₉＝225%	Ⅲ₃＝y₃＋y₅＋y₇＝220%
k_j	k₁＝3	k₂＝3	k₃＝3
Ⅰ_j/ k_j	Ⅰ₁/k₁_＝70.33%	Ⅰ₂/k₂_＝74.67%	Ⅰ₃/k₃_＝76.67%
Ⅱ_j/ k_j	Ⅱ₁/k₁_＝78%	Ⅱ₂/k₂_＝74.33%	Ⅱ₃/k₃_＝74%
Ⅲi/ k_j	Ⅲ1/k₁_＝75.67%	Ⅲ2/k₂_＝75%	Ⅲ3/k₃_＝73.33%
极差（D_j）	max{ }-min{ }＝_7.67%	max{ }-min{ }＝0_.67%	max{ }-min{ }＝3.34%

注：

Ⅰ_j	第j列“1”水平所对应的试验指标的数值之和；
Ⅱ_j	第j列“2”水平所对应的试验指标的数值之和；
Ⅲ3	第j列“3”水平所对应的试验指标的数值之和；
k_j	第j列同一水平出现的次数。等于试验的次数（n）除以第j列的水平数。
Ⅰ_j/ k_j	第j列“1”水平所对应的试验指标的平均值；
Ⅱ_j/ k_j	第j列“2”水平所对应的试验指标的平均值；
Ⅲj/ k_j	第j列“3”水平所对应的试验指标的平均值；
D_j	第j列的极差。等于第j列各水平对应的试验指标平均值中的最大值减最小值，即 D_j＝max{Ⅰ_j/ k_j ，Ⅱ_j/ k_j ，… }-min{ Ⅰ_j/ k_j ，Ⅱ_j/ k_j ，… }

推论：因为D1>D3>D2,表明温度对啤酒酵母细胞破壁的影响最大，食盐浓度的影响次之，pH的影响最弱。并且得出最佳破壁条件：温度为：50℃ 、PH为：5.5 、食盐浓度为：1%。

2 结果讨论与最终确定

2．1 讨论与结论

本论文通过对利用啤酒酵母自溶法破壁生产酵母菌抽提物的研究主要得出以下结论:

通过一系列单因子影响实验与多因子影响正交实验，发现温度对啤酒酵母细胞破壁影响最大（对正交试验进行极差分析方法知D1>D3>D2,表明温度对啤酒酵母细胞破壁的影响最大，食盐浓度的影响次之，pH的影响最弱。单因子影响实验条件下：温度为50℃时，细胞破碎率最大；多因子影响实验条件下最佳破壁条件下温度也为50℃）；并且得出自溶法破壁最佳破壁条件：温度为：50℃ 、PH为：5.5 、食盐浓度为：1%。

2．2 最终确定

得出啤酒酵母细胞自溶法破壁最佳破壁条件：温度为:50℃ 、pH为:5.5 、食盐浓度为:1%。

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dong3626

第5楼2010/12/07

应助达人

破壁自溶后怎么处理？

对其中的有效成分或者有用的成分又怎么利用？

分
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省部重点实验室

第6楼2010/12/07

其中的有效成分就像酵母抽提物&酵母粉剂

这项工作的意义是啤酒发酵完了以后经常把酵母倒掉没有充分的利用

现在可以再利用 !!
dong3626(dong3626) 发表:破壁自溶后怎么处理？

对其中的有效成分或者有用的成分又怎么利用？

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机枪射手

第7楼2010/12/08

楼主有没有做过超声破菌提取包含体的工作？

分
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私聊

省部重点实验室

第8楼2010/12/08

现在我们是破碎大肠杆菌提取蛋白！！

O(∩_∩)O~ 有高压匀浆机还有超生破碎的

一个是制备级的一个是分析用的 (*^__^*) 嘻嘻……
Alt(z14753) 发表:楼主有没有做过超声破菌提取包含体的工作？

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柠檬酸酸

第9楼2014/04/25

用酵母抽提物得到什么有效物质么？

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qlyhzau

第10楼2014/05/14

[div]原文由gl19860312发表：

现在我们是破碎大肠杆菌提取蛋白！！

O(∩_∩)O~ 有高压匀浆机还有超生破碎的

一个是制备级的一个是分析用的 (*^__^*) 嘻嘻……[/div]你们得制备均质机是什么牌子的？我们实验室也像买一个