【第三届原创大赛】酶联免疫定量测试盒法测黄曲霉毒素B1的方法探讨

abcdefghijkl123

2010/12/23

私聊

食品安全/营养与健康

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酶联免疫定量测试盒法测黄曲霉毒素B₁的方法探讨

摘要：本文主要通过pH值、阳离子（如Cu²⁺、Fe³⁺等）、溶液呈色（如红曲）来探讨酶联免疫测试盒法测黄曲霉毒素B₁时对样品的提取方法为什么用甲醇水溶液提取会出现假阳性，干扰测定，必须进一步用三氯甲烷来提取黄曲霉毒素B₁以消除干扰。

关键词：pH值阳离子溶液呈色黄曲霉毒素B₁假阳性

黄曲霉毒素B₁是剧毒物质，具有极强的致癌性和致突变性。人或动物在食入被AFB₁污染的的食品或饲料后，经新陈代谢作用，就会转变为黄曲霉毒素M₁、P₁等物质，从而影响人类健康。因此世界各国高度重视黄曲霉毒素B₁的控制和检测。

一、实验

1、试剂及仪器：黄曲霉毒素B₁酶联免疫定量测试盒、甲醇水溶液（1+1）、三氯甲烷、

ELISA-95型酶标仪、酸度计、微量移液枪

2、溶液

2.1、pH值为2.2，3.0，、4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，12.0的磷酸盐缓冲液

2.2、Cu²⁺溶液：0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0（mg/mL）

2.3、Fe³⁺溶液：0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7（mg/mL）

2.4、红曲水溶液

3、实验方法

3.1、样品提取液

3.1.1、取5克试样,精确至0.01克，于50mL磨口试管中，加入1:1甲醇水溶液25.0mL，加塞振荡10分钟，过滤，充去初滤液，再收集试样滤液。根据所测样品的不同限量值用黄曲霉毒素B₁酶联免疫定量测试盒中的A试剂作为稀释剂进行适当稀释，为待测试液。

3.1.2、如果按3.1.1方法提取的样品待测试液呈阳性的结果或有颜色而干扰测验定时，应再用三氯甲烷对3.1.1中试样滤液依下列步骤进行提取。

准确吸取10.0mL滤液（相当于2克样品）于125mL的分液漏斗中，加入15mL三氯甲烷，加塞振荡3分钟，静置分层（如有乳化现象可滴加甲醇促使分层）。放出三氯甲烷层，经盛有约10克预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于50mL蒸发皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取2次，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，滤液滤于蒸发皿中。将蒸发皿放入通风橱，65℃水浴通风挥干。准确加入10.0mL1:1甲醇水溶液，将凝结物充分溶解，根据所测样品的不同限量值用黄曲霉毒素B₁酶联免疫定量测试盒中的A试剂作为稀释剂进行适当稀释，为待测试液。

3.2、样品测定

从冰箱中取出黄曲霉毒素B₁酶联免疫定量测试盒，平衡至室温。用1.5mL酶标稀释液D试剂稀释冻干酶标抗原，制成实验用酶标抗原溶液为C试剂；准备好洗涤液。

用洗涤液洗板2次，拍干。选择两孔分别加入50μLAFB₁阴性对照液（0.1ng/mL），50μLAFB₁阳性对照液（1ng/mL）进行限量分析，（若要作标准曲线定量分析，则选择数孔分别加入AFB₁系列标准溶液），其余孔中各加入50μL待测样品提取液，再加入50μL酶标抗原溶液于各孔中；加入50μLA试剂，再加入D试剂50μL作为空白孔，摇匀。37℃孵育30分钟。甩干，涤洗5次，拍干。往各孔中分别加入50μL基质液和50μL显色剂，37℃显色15分钟，如果颜色显色较浅，可适当延长显色时间。观察各孔的颜色与阴、阳性孔的蓝色比较,要进行定量分析，则往各孔中分别加入50μL终止液，并在酶标仪450nm波长处测定各孔吸光度值A。

3.3实验结果

实验结果见表1：标准曲线各点数值及图1：黄曲霉毒素B₁标准曲线方程

表1 标准曲线各点数值

编号
ng/ml

吸光度A值

1
0

2.101

A*100/A₀

lgC

2
0.1（阴性孔）

1.738

82.72

-1

3
0.25

1.397

66.50

-0.602

4
0.5

0.872

41.50

-0.301

5
1.0（阳性孔）

0.612

29.13

0

6
2

0.305

14.52

0.301

波长

450nm

黄曲霉毒素B₁标准曲线方程

二、干扰分析

1、pH值对ELISA测定的影响

将pH值为2.2，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，12.0的磷酸盐缓冲液作为试样分别按3.1.1和3.1.2处理后进行ELISA测定；所得的结果见图2：pH值对ELISA测定的影响。

▲阴性线 ■阳性线 ○有机相三氯甲烷提取液 ◆pH缓冲液试液

图2 pH值对ELISA测定的影响

从图可以看出，样品提取液的pH值对结果影响很大。当pH值小于5值，结果显假阳性；从图中也可知，采用有机相三氯甲烷萃取时，样品提取液的pH值对ELISA测定的影响得以消除。

2、重金属离子（如Cu²⁺、Fe³⁺等）对ELISA测定的影响

从图3、图4可以看出， Cu²⁺铜离子对ELISA测定有一定的影响，当Cu²⁺铜离子浓度超过0.6mg/mL时，结果显假阳性，当Cu²⁺铜离子浓度超过1.0mg/mL时，曲线变得平缓，即Cu²⁺铜离子对ELISA的影响趋于恒定；当Fe³⁺浓度超过 0.1mg/mL时，对ELISA测定的影响显著增强，Fe³⁺浓度为 0.3mg/mL以上时，测定结果呈假阳性。

饲料（特别是浓缩料）、复杂成分的食品等添加了很多的微量元素、化学物质，当用甲醇水溶液（1+1）提取黄曲霉毒素B₁出现假阳性时，须用三氯甲烷有机相进一步提取。

▲阴性线 ■阳性线 ○有机相三氯甲烷提取液 ◆铜离子溶液试样

图3 铜离子浓度对ELISA测定的影响

▲阴性线 ■阳性线 ○有机相三氯甲烷提取液 ◆铜离子溶液试样

图4 铁离子浓度对ELISA测定的影响

3、呈色溶液

用甲醇水溶液（1+1）来提取有色物质（如红曲粉等）的黄曲霉毒素B₁时，颜色会残留在甲醇水溶液（1+1）相中，从而干扰颜色的分析判断，进一步用三氯甲烷提取黄曲霉毒素B₁时，可消除干扰。

三、讨论

1、pH的影响

pH值对ELISA测定的影响机理很复杂，较多的是集中在对酶及催化底物的影响。当pH值低于5时，酶标抗原中的酶的结构发生不可逆的变化并丢失大部分活性，导致显色反应时颜色偏浅，使结果出现假阳性。

2、重金属的影响

重金属对ELISA测定的影响归根结底是对酶标抗原中酶的影响。这些物质主要与酶蛋白的巯基以共价键结合，甚至还能和羟基、氨基和吲哚基结合，酶被修饰而失活。重金属对酶的抑制作用随着重金属离子浓度的增加而增加；若重金属离子的量足以结合所有的酶，则将出现完全抑制，即酶分子与重金属离子完全生成不可分解的络合物，无法催化底物显色，造成颜色偏浅而显阳性结果。

四、总结

甲醇水溶液毒性小，价格便宜，用其来提取黄曲霉毒素B₁更有利于实验人员的操作安全。只有当用甲醇水溶液测黄曲霉毒素B₁出现假阳性、有颜色干扰时，再用三氯甲烷来进一步提取，其毒性相对于甲醇来说更大，价格高，但其极性比甲醇大，可将黄曲霉毒素B₁从甲醇水溶液层转移到三氯甲烷层，而干扰物质（如pH、Cu²⁺、Fe³⁺、呈色物质等）仍留在甲醇水溶液层，从而消除了干扰。

参考文献

1、江苏省微生物研究所编，黄曲霉毒素B₁酶联免疫定量测试盒操作说明书

2、 GB/T5009.22-2003 食品中黄曲霉毒素B₁的测定方法

3、赵晓联，赵春城等，酶联免疫吸附法测定黄曲霉毒素B₁误差分析[J]，中国卫生检验杂志，2001，11（4）473～475

附件：

酶联免疫定量测试盒法测黄曲霉毒素B1的方法探讨.doc

精
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编号	ng/ml	吸光度A值
1	0	2.101	A*100/A₀	lgC
2	0.1（阴性孔）	1.738	82.72	-1
3	0.25	1.397	66.50	-0.602
4	0.5	0.872	41.50	-0.301
5	1.0（阳性孔）	0.612	29.13	0
6	2	0.305	14.52	0.301
波长		450nm