【线上讲座47期】紫外-可见分光光度法新项目开发解决方案（提问十积分奖励）

现在有些分析工作者都是按照国家标准进行检测，而这些标准中都是相对很成熟的方法。只需按照国家标准配制相应的试剂，有一台分光光度计就可以操作了，而往往忽略了对方法的开发工作。我个人认为方法开发工作相当的重要，按照国标操作只是机械的重复，用一个版友的话讲，叫照方抓药。不希望大家只会‘抓药’，而且要会‘看病’。这里所说的看病就是对方法的开发。

其实我不做紫外已经三四年了，还是当时积累的一些知识，在此和大家分享一下，有什么不妥的请拍砖。

1测定组分和样品的确定

首先确定你要测定的组分及其样品。组分确定了，首先要搞清楚此组分的一些性质。有没有共轭双键啊，在紫外区有没有吸收啊，如果有，问题已经解决了一半。如果在紫外区没有吸收，那就要考虑用到显色剂。

花开两朵，各表一枝。先说在紫外区有吸收的情况。我一般拿到一个测定组分，首先查找国内外相关文献，看是否有用分光光度法测定过的例子，这样可以走一个捷径。如果没有，那就相对麻烦一下。我以我做过的纳他霉素作为例子进行说明。

当时查了很多文献，说纳他霉素有紫外吸收，就奠定了测定的基础。先看纳他霉素的一些物理化学性质。




文献我只简单罗列了几个，当时查了很多文献，尤其关注纳他霉素的溶解性，最后确定用甲醇和醋酸的混合溶液去溶解纳他霉素。


我说这个的意思是，组分的性质直接影响用啥溶剂去溶解组分。有时即使对同一组分，溶剂不同，其最大吸收波长可能也不同。所以在说明组分的最大吸收波长时，一定要注明溶剂。

2 最大吸收波长的确定

当确定了用适当的溶剂去溶解组分后，就要配制一个中等浓度的标准溶液去做全波长扫描，从而确定最大吸收波长。

至于浓度的选择，组分不同，其摩尔吸收系数也不相同，建议先配一个50PPM的溶液，去上机测定，控制其吸光度在0.6左右最好。如果吸光度太大，需要稀释，同理，如果吸光度太小，则需要重新配制。

当然这个不是硬性规定，也要充分考虑到方法本身和样品中组分中含量，我曾经做过硝酸盐和亚硝酸盐的检测，标准曲线最高点吸光度0.2，样品吸光度一般在0.1左右。

2.1具有扫描功能仪器的最大吸收波长的选择

以2μg/ml纳他霉素溶液测定样品溶液,分别对扫描速度和采样间隔分别进行试验,得出最佳采集条件.

2.1.1扫描速度

UVPROBE软件提供了四种扫描速度，分别是低速(very slow)、慢速(slow)、中速(medium)、高速(fast)。本试验采用了上述四种速度进行扫描。仪器条件为：采样间隔0.5,狭缝宽度2.0nm,氘灯转换波长360nm,扫描方式为自动。测定结果见表1:




以上数据表明:在没有特别精确要求下,中速、慢速、低速扫描基本没有区别,但和快速扫描的区别比较大。从扫描时间和氘灯使用寿命等因素考虑，建议采用中速扫描。

2.1.2采样间隔

采用0.05为采样间隔时，仪器以0.05nm为单位进行扫描，即自动在1nm范围内插入1/0.05=20个点。其它条件不变。仪器条件为：扫描速度为低速，狭缝宽度2.0nm,氘灯转换波长360nm,扫描方式为自动,结果见表2:




从上表可以看出 , 0.05-0.5的采样间隔对最大吸收波长基本没有影响，但1.0和2.0的采样间隔则影响比较大。从图上可以看出,采用0.05、0.1、0.2、的采样间隔,其谱图平划,而0.5、1.0、2.0的采样间隔,其谱图都不是非常平滑。所以，在没有特别精确要求下, 采用0.05-0.2的采样间隔均可，但0.5、1.0、2.0的采样间隔则对测定结果有一定影响。从扫描时间和氘灯使用寿命等因素考虑，建议采用0.2的采样间隔。

2.1.3狭缝宽度

从理论上讲，狭缝宽度越小，波长越接近单色光，但带宽太小，将使单色光的强度减小，使光电流信号减弱，降低信噪比。

2.2没有扫描功能的仪器的最大吸收波长的选择

比如7230一类的不具有计算机和工作站的仪器，不具有扫描功能的仪器，有人说就不好寻找最大吸收波长。其实任何事情总能追溯源头，最早科学家的方法现在仍然适用。我们找一张坐标纸，以0.5nm或1nm为单位进行吸光度的测定，在全波长范围内就会出现很多数据点，再用平滑的曲线将这些点连接起来，就是一条吸收曲线。当然，如果溶液没有颜色，可以只在紫外区优化，如果有颜色，可以只在可见区优化，这样减少了很多的工作量，没必要全波长优化。

3 样品的前处理

其实所有检测方法的开发，最难的也是在样品前处理阶段。由于分光光度法的特殊性，不具有分离的功能，所以，只能在样品前处理阶段尽可能的处理掉对测定具有干扰的组分。在这里我介绍几种简单的消除干扰的方法。

3.1 利用干扰组分和待测组分性质的不同去除干扰组分

一般采用萃取等方法，利用干扰组分和待测组分溶解性的不同，将干扰组分从体系中分离出去，这是最简单最实用的方法。

3.2选择不具有干扰的波段进行测定

在3.1的方法不奏效的时候，确定在最大吸收波长处有干扰，可以选择避开最大吸收波长，而选择不具有干扰的波段进行测定。但这样将以牺牲灵敏度为代价。

3.3利用合理的参比进行消除

合理的参比溶液是消除基体影响的一个很好的方法。

3.3.1原理

当一束平行光通过均匀的液体介质时,光的一部分被吸收,一部分透过溶液,还有一部分被器皿表面反射.假设入射光强度为I0(其实我不喜欢这么表示,还要弄下标,麻烦,可是很多书上都这么些,哎,没办法),吸收光强度为Ia,透射光强度为It,反射光强度为Ir,

(其中a表示absorption吸收,t表示transmittance透射,r表示reflection反射,嘿嘿,方便记忆,还顺便学几个单词,写论文有用)

则I0=Ia+It+Ir (1)

在分析过程中,被测溶液和参比溶液一般是分别放在同样材料和厚度的吸收池中(地球人都知道,又废话了),让强度为I0的单色光分别通过两个吸收池,再测量透射光的强度.所以反射光的影响可以相互抵消.(但是又有新的问题了,如果这样的话,那以前的单光束仪器岂不一直存在着反射光的影响,这个问题我想发个帖子单独讨论)

所以(1)式就被简化了:

I0=Ia+It (2)

透射光的强度 It与入射光的强度I0之比称为透射比,用T表示,那么,又有公式出现了,不过很简单:

T=It/I0 (3)

当然还有T和A的公式,大家都知道,我这里就不说了.

以上说了半天,就为说明一个问题,参比可以消除由于吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差.

3.3.2参比溶液的原则

既然有这好处,那下来吸收池里装什么就成了问题的关键,有好多中情况,有的我试验过,有的由于条件限制没有试验,如果有不对的地方,别拍我啊.

3.3.2.1当试液和显色剂都没有颜色时,可以用去离子水作为参比溶液.

3.3.2.2当显色剂没有颜色,而被测试液中存在其他有色离子,可用不加显色剂的被测试液作为参比溶液.

3.3.2.1和3.3.2.2很常用,尤其是3.3.2.2.我当时做果酱中亚硝酸盐的时候就遇到过这个问题,当时也想了很多办法,活性炭脱色,过柱子,掩蔽等,最后还是觉得用参比比较好,有兴趣的可以参考一下我写的论文<<双光束分光光度法测定果酱中的亚硝酸盐>>,我会上传的.

3.3.2.3显色剂有颜色,可以选择不加试样溶液的试剂空白做参比.

3.3.2.4显色剂和试液都有颜色,可将一份试液加入掩蔽剂,将被测组分掩蔽起来,使之不再和显色剂作用,而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入,以此来做为参比溶液,这样就可以消除显色剂和一些共存组分的干扰.

3.3.2.5改变加入试剂的顺序,使被测组分不发生显色反应,可以此溶液作为参比溶液消除干扰.这个方法操作起来比较困难,我没试验过,因为我的显色剂一加进去就有颜色了.

3.3.3单光束分光光度计实现参比的方法

不知道这方法行不行,存在一定的问题,但是也有一定的参考价值.

制作一个参比溶液,用空白校完仪器后放入,测定其吸光度,然后在制作标准曲线和测定样品的时候,同时减去参比的吸光度.

例如,用空白校完仪器后,测定参比的吸光度为0.006,而样品测定吸光度为0.447,则带入标准曲线计算的实际吸光度为0.441.这样就扣除了参比对测定结果的影响.

3.4 固相萃取

现在用的比较火的一种前处理方式，这种方式能很好的消除干扰组分而很好的保留待测组分。其缺点的固定相的选择上存在一定的困难，而且成本相对较高。

3.5利用导数光谱消除干扰

这种方法在具有工作站的仪器上具有很大的优势，工作站带有导数处理功能，可以将干扰组分求导后进行消除。

以上是我所介绍的关于条件的选择，感谢zhouyuhu版主所做的指导，我是一个新人，希望以后和大家多请教和学习，谢谢。

问题汇总……

感谢0101和zhenduanye的这次讲座，大家要踊跃参加呀