[资料]毛细管电泳的模式及应用

缓冲液中加入溶质后，一部分溶质分子按分配机理与载体结合并随载体迁移
另一部分溶质分子不与载体结合。非结合型溶质分子随着整个缓冲液以电渗流形式迁移，其方向取决于缓冲液与毛细管内壁间的双电层电势。当毛细管内带负电 (即硅胶毛细管在 pH 中性条件下)，电渗流就向负极迁移。结合型溶质分子与整个分子数的比率取决于溶质与载体的结合能力，支配着各溶质组分的相对迁移率，从而分离各溶质组分。
胶束电动毛细管色谱的分配原理与常规色谱相同，然而胶束电动毛细管色谱的载体与常规色谱的固定相不同，它并不固定于柱，也不形成与流动相性质截然不同的一相，而是在缓冲液中均匀分布。需要说明的是 MEKC 的载体同周围介质的迁移速度不同。
电动色谱中以含有载体 (准固定相) 的缓冲液代替了 CZE 的电泳缓冲液。根据载体类型的不同，MECC 可分为：
①    胶束电动色谱 (miccellar electrokinetic chromatography，MEKC)；
②    环糊精电动色谱 (cyciodextrins electrokinetic chromatography，CDEKC)；③离子交换电动色谱 (ion exchange electrokinetic chromatography，IEEKC)；④微滴乳状液电动色谱 (microemulsion electrokinetic chromatography，MEEKC)。在胶束电动色谱和 环糊精电动色谱的基础上，环糊精修饰的胶束电动色谱 (CDMEKC) 也逐渐发展，构成电动色谱很重要的一个分支。
第四节 毛细管电色谱基础
毛细管电色谱 (capillary electrochromatography，CEC) 是在毛细管中填充或在毛细管壁涂布、键合色谱固定相，依靠电渗流 (EOF) 推动流动相，使中性和带电荷的样品分子根据它们在色谱固定相和流动相间的吸附、分配平衡常数的不同和电泳速率的不同而达到分离目的的一种分离模式。
毛细管电色谱是 HPLC 和 CE 的有机结合。实际上，也可以说毛细管电色谱就是用电渗流或电渗流结合压力流来推动流动相的微柱液相色谱。
历史:
20 世纪 50 年代初期，Muold 等就将电场引入薄层色谱系统，利用电渗流作薄层色谱流动相的推动力，分离了胶棉中的多糖成分。
1974 年，Pretorius 将电场引人毛细管填充柱色谱，首次向世人示范了毛细管电色谱，并展示了 CEC 对不保留溶质的分离效率明显高于 HPLC。但是，由于他采用的柱直径相对较大，实验结果没有能把毛细管电色谱的优越性充分显示出来。
1981 年，Jorgenson 等发表的在毛细管电泳史上具有里程碑意义的论文中报道，将 10 m 十八烷基硅烷 (ODS) 填料填入内径 170 m 的 Pyrex 玻璃柱，成功地分离 9-甲基蒽等多环芳烃，第一次向世人展示了毛细管电色谱的巨大潜力。
次年，Tsuda 采用 30 m 内径的 ODS 键合钠钙玻璃开管柱，在 13kV 电压下成功分离了毛细管区带电泳难以分离的苯、萘、联苯、蒽等芳香化合物，进一步证明了毛细管电色谱的高效性。 Martin 等研究了开管柱电色谱的轴向扩展及峰展宽，从理论上证实了用电渗流推动流动相的优越性。
1985 年，0'Farell 讨论了在毛细管电色谱中使溶质在柱内富集的前提条件。后来，Knox 进一步研究了大量有关填充柱电色谱的理论问题，弄清了影响填充柱电色谱中峰展宽的因素，从理论和实验土证明了 CEC 的分离效率明显高于 HPLC，指出了制约毛细管电色谱发展及应用的一些关键问题。
1991 年，他纠正了早期电色谱工作中的一些缺陷，从理论上讨论了填料大小、电解质溶液浓度与电渗流速度及柱效间的关系。Yamamoto 在研究中进一步验证了 Knox 的理论。Tsuda 研究了电色谱中的色谱行为，设计了连续进样电色谱，并实现了 CEC 对样品的富集。至此，有关电色谱的理论基础已全部建立，电色谱也被越来越多的人所接受。
CEC 是在高效毛细管电泳技术不断发展与 HPLC 理论、技术进一步完善的基础上，不仅将 HPLC 中众多高选择性固定相引入毛细管，克服毛细管区带电泳选择性不够高、不能分离中性化合物的局限性，而且以电渗流代替压力流，克服了 HPLC 中压力流 (是层流) 引起的峰扩展，使柱内无压降，获得了接近于 CE 水平的高柱效。
CEC 的突出特点：
① 分离效率比 HPLC 高 5~10 倍；
② 选择性比毛细管电泳高；
③ 分析速度快，分析结果重复性好；
④ 能实现样品的富集和预浓缩。
一、毛细管柱的类型分类
填充柱毛细管电色谱
开管柱毛细管电色谱。
1. 填充柱毛细管电色谱
将 HPLC 填料用适当的方法填人毛细管柱，用电渗流或电渗流结合压力流推动流动相进行分离分析的技术

在填充柱毛细管电色谱中，固定相填料往往使毛细管中的流通通道与轴向呈一夹角，使溶质在柱内的移动距离增加，柱内有效电场强度下降；并且由于只能在多孔填料外面才能产生电渗流，故填充柱毛细管的电渗流速度比较小，约为开 管柱的 40%~60%。
稳定，重复性:
填料的巨大比表面使填充柱对柱表面污染不敏感，所以填充柱电色谱的流速及分离结果都比较稳定，重复性好。
检测:
紫外光难以穿透硅胶颗粒，必须把 UV 检测器装在没有填料的毛细管部分才能实现 CEC 柱上检测。
典型的填充柱毛细管电色谱基本装置如图 15-12 所示。
柱效;
在填充柱毛细管电色谱中，因柱内无压降，流动相的流型基本为塞式平流，和 HPLC 靠压力驱动的流动相为层流相比，区带展宽小，理论塔板数要高得多。
近来的研究表明，填充柱毛细管电色谱对非保留溶质的塔板数高达 40 万/m，对于有保留的溶质塔板数也能达到 15 万~20 万/m。
目前填充柱毛细管电色谱的主要问题是：
①    制备高分离效率的毛细管填充柱较为困难；
②    气泡问题，即在进行填充柱毛细管电色谱分离时，电极反应及填料与空柱间存在的速度差很容易使柱内产生气泡，造成电流中断，使分离失败。
③    当电解质浓度超过 6mmol/L 时，柱内也容易产生气泡。所以，填充柱毛细管电色谱的操作中，选择缓冲液的浓度就格外重要。Knox 研究指出，缓冲液浓度在 2mmol/L 左右时比较合适，不容易产生气泡。但是，当采用低电导的缓冲体系时，可使用较高浓度的缓冲溶液，并且能增加分离的重现性。

2. 开管柱毛细管电色谱
将色谱固定相用化学的或物理的方法涂渍在毛细管内壁，用电渗流或电渗流与压力一起驱动流动相的分离技术
如果不加压力驱动，在普通毛细管电泳仪上就可以进行开管柱毛细管电色谱操作。
因为把固定相交联或键合在毛细管柱内壁上，涂层稳定，不易被流动相冲掉。同时，因为柱表面硅羟基被屏蔽一些，电渗流比毛细管区带电泳明显减小。所以开管柱毛细管电色谱分离度高、分离的重复性比较好。
早在 1982 年，Tsuda 就用开管柱毛细管电色谱成功分离了 CZE 难以分离的苯、萘、联苯、蒽等芳香化合物。后来，
Mayer 将环糊精聚硅氧烷固定相在柱内交联并分离了手性化合物。Cuo 用溶胶-凝胶法制备了 C8-涂层柱用来分离多环芳烃；
Chevolleau 用 C18-键合柱分离了β-兴奋剂混合物。证明了开管柱毛细管电色谱具有良好的应用前景。
二、按流动相的驱动力分类
按照流动相的驱动力，毛细管电色谱分为电渗流驱动的毛细管电色谱和电渗流与压力联合驱动的毛细管电色谱。
1. 电渗流驱动的毛细管电色谱
电渗流驱动的毛细管电色谱可以在一般 CE 商品仪器上进行，是目前研究较多的电色谱。
优点: 实现高效、高选择性分离
引入了高选择性的色谱固定相，提高了电泳的分离能力，又克服了压力驱动的压力流引起的区带展宽。
不足:电渗力的限制，难以驱赶出在电泳过程中产生的气泡，电泳操作常因气泡而中断，使实验失败。
2. 电渗流与压力联合驱动的毛细管电色谱
1)加压作用:
在电渗流与压力联合驱动的毛细管电色谱中，液相泵产生的压力流可以将操作中产生的气泡冲出毛细管或者使气体在高压下溶解，从而解决了填充柱电色谱在电泳过程中产生气泡的问题。
2) 用电渗流和压力联合驱动的流动相，不仅使流动相的平均线速度比相同条件下的 HPLC 中的大，缩短分析时间，而且能减小压力流引起的区带展宽，使分离效率比 HPLC 明显提高，操作的稳定性及重复性也更好。
注意问题:防止高电压对泵可能造成损伤。
三、毛细管电色谱原理
毛细管电色谱 (capillary electrochromatography，CEC) 是毛细管电泳与毛细管液相色谱结合的一种分离技术。它的分离机制包含有电泳迁移和色谱固定相的保留机理。
电渗流 在毛细管电色谱中，电渗流对分离结果及分析的重现性有重大影响
当毛细管开管柱中背景电解质溶液的 pH 值等于或大于 3 时，毛细管内表面的硅羟基开始解离，解离的硅羟基因静电引方吸引背景电解质溶液中的阳离子，在毛细管内壁形成双电层。当毛细管两端施加高电压时，产生流向阴极的电渗流。
填充毛细管中的电渗流速度大小为
(15-28)
式中 ——无量纲的因数，根据填充床的弯曲度和疏松程度不同，其数值为0.4~0.7；
、 ——电泳操作时的电场强度和电压；
——毛细管的长度；
——背景电解质溶液的黏度；
——填料颗粒表面与电解质溶液界面双电层的 Zeta 电势，其大小为 ；
——填料颗粒表面与电解质溶液界面双电层的厚度；
    ——毛细管内壁扩散层单位面积的过剩电荷数。
对于二元电解质溶液 , 其双电层的厚度

式中， 、 分别为真空介电常数和背景电解质溶液的介电常数； 为气体常数； 为实验时的绝对温度； 、 分别为背景电解质溶液的浓度和法拉第常数。
电渗流速度就与填料大小的关系
只要填料颗粒表面的双电层不重叠 (填料粒径≥0.5 m)，电渗流速度就与填料大小无关。
对于既定的背景电解质溶液，在操作电压一定的情况下，填充毛细管中的电渗流为一定值，流动相的线速度一定(不像 HPLC 的流动相线速度明显受填料粒度大小的影响)。
CEC 中作为流动相的背景电解质溶液线速度不受填料粒度、填充均匀程度等的影响，因而分离效率高，重复性好。
同毛细管电泳一样，毛细管电色谱中的电渗流淌度大于大多数溶质离子的电泳淌度。因而，电渗流带动溶质离子一起向阴极移动。
2. 保留机制
溶质在电色谱中的迁移速度和电渗流速度、溶质的电泳速度以及溶质在流动相之间的分配情况有关。其大小可用下式表示
(15-29)
(15-30)
式中， 、 分别为系统的电渗流速度和溶质的电泳速度； 为溶质在毛细管系统中柱容量因子，其大小决定于溶质在固定相与流动相间的分配系数； 、 分别为固定相、流动相的体积； 、 分别为溶质在固定相、流动相间达到分配平衡时，溶质分配到固定相、流动相中的量； 为溶质在两相间的分配系数。
中性物质在 CEC 中的迁移速度为
(15-31)
上述公式说明,溶质在 CEC 中的保留性能与它在系统的固定相与流动相间的分配系数有关。所以，在 CEC 中，离子型化合物的保留机制既有电泳机制，也有色谱的分配机制；而对于中性化合物溶质，只有色谱分配机制了。
3. 分离效率
在 CEC 中，分离效率仍用理论塔板数 或理论塔板高度 表示。影响分离效率的因素可用 van Deemter 方程描述
(15-32)
式中 、 ——分别代表溶质在流动相和填充颗粒内部的扩散系数；
、 ——分别代表流动相的线速度和填充颗粒的粒度；
、 、 ——分别代表 van Deemter 方程常数。
对于开管柱毛细管电色谱，涡流扩散项 等于零。对于填充毛细管由色谱，由于流动相是塞式平流，与填料颗粒直径一般仅在 1.5~3.0 m，所以涡流扩散项 和在 HPLC 中 的相比很小，可以忽略。式中的第三项为传质阻力项，其大小主要由溶质在填充颗粒内部的扩散系数决定。在 CEC 的一般操作条件下，传质阻力引起的区带展宽很小，对塔板高度的贡献可以忽略。
效率比较:在理想情况下影响 CEC 分离效率的因素就只有纵向扩散项。这是 CEC 分离效率大大高于 HPLC 的根本原因。再者，CEC 采用柱上检测和电动进样， 死体积和进样量都比     HPLC 小得多，也是 CEC 分离效率高的重要原因。
四、毛细管电色谱实验条件的选择
像 CE、HPLC 一样，毛细管电色谱的实验条件选择主要有以下几方面。
1. 操作电压
由填充柱毛细管电色谱中电渗流速度大小公式可知，增加操作电压可以增大电渗流速度，缩短分析时间。由于填充柱毛细管电色谱中的电渗流比开管柱毛细管电色谱的电渗流低很多 (仅是开管柱毛细管电色谱的 40%~60%)，工作电流很小，柱中的热效应小，焦耳热可以忽略。所以，从提高电渗流速度、缩短分析时间考虑，可以选用很高的工作电压。但是，过高的工作电压，比如在 1000V/cm 以上时，柱内易产生气泡，使实验中断，严重时可能使柱子报废。
2. 缓冲溶液 pH 值
缓冲溶液 pH 值明显影响电渗流。一般而言，随着缓冲溶液 pH 值增大，系统的电渗流增大，溶质表观迁移速度加快，而柱容量因子基来不变。因此，通过提高缓冲溶液 pH 值，可以达到提高分析速度的目的。
3. 背景电解质浓度
背景电解质浓度增加，使双电层压缩、变薄，并且使电解质离子间形成离子对的概率增大，溶质表面有效电荷减小。所以，提高背景电解质浓度，可使电渗流速度下降。另一方面，背景电解质浓度增加，使工作电流增大，热效应增大，过高的焦耳热极易使填充柱电色谱系统产生气泡。所以，填充柱电色谱中背景电解质浓度一般不超过 6mmol/ L，一般以 2mmol/L 为宜。如果采用低电导的电解质体系，工作电流比同浓度下的高电导电解质体系要低得多，热效应引起的气泡问题就小得多，此时可以采用高浓度的背景电解质体系。
4. 有机溶剂
往缓冲溶液中加入有机溶剂时，引起溶液黏度、介电常数变化，必然引起电渗流速度和溶质迁移时间变化。在毛细管电泳中，一般来说，加入乙腈和增加乙腈在缓冲溶液中的比例，使电渗流减小。但是在毛细管电色谱的实验中发现却与之相反：随着加入乙腈浓度的增加，电渗流线性增大。所以，提高乙腈浓度，电渗流速度增加，可以提高冲洗能力；降低乙腈浓度，电渗流速度减小，可以提高 CEC 的分离度。
5. 采用分步梯度洗脱
对于难分离的物质，可以像 HPLC 那样采用梯度洗脱的方法，即在分析过程中采用适当方法，按一定程序更换盛有不同浓度缓冲溶液和有机溶剂的样品瓶来实现 CEC 的梯度洗脱，从而改善分离。图 15-13 所示为在其他条件不变的情况下，仅流动相的乙腈 (ACN) 浓度在 12min 内从 30% 变到 45%，CEC 分离 10 种 类化合物的电色谱图。采用梯度洗脱的办法，可以明显改善 CEC 的分离情况。