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三、实验程序
(一)微生物的分离
1. 用稀释平板法(又名混菌法)从土壤中分离真菌。
(1)制备土壤稀释液
无菌操作过程
A. 取土壤5g,放入装有45mL无菌水的三角瓶中,振荡10min,即为稀释10-1的土壤悬液。
B.另取装有9mL无菌水试管5支,用记号笔编上10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。取已稀释成10-1土壤液,振荡后静止0.5min,用无菌吸管吸取 1mL土壤悬液加入10’的无菌水的试管中,并在试管内轻轻反复吹吸数次,使之充分混匀,即成10-2土壤稀释液。同法由10-2的试管中吸取1mL稀释液加入编号为10-3的无菌水试管中,混匀后即为10-3土壤稀释液,依次连续稀释至10-4、10-5 、10-6土壤稀释液。
在土壤稀释过程中,以用一支吸管由浓到稀,稀释到底,稀释方法见图7-1。
图7-1 检样的稀释方法
图7-2 倒培养基平板a. 皿加法b. 手持法
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2. 用平板涂抹法分离土壤中的放线菌(土壤稀释液制备同上)。
①每组取无菌培养皿2付。各在培养皿底部贴上标签,注明分离菌名、稀释度。
②以无菌操作法先在培养皿中加入0.5%重铅酸钾溶液2滴,取已融化的淀粉琼脂培养基2管,分别倒入2付培养皿中,轻轻转动培养皿,使培养基与重铅酸钾充分混匀,铺平,制成平板。
③待平板凝固后,另取一支吸管吸取10-3或10-4稀释液0.2mL土壤稀释液放在平板上。
④取无菌三角玻棒,把上述稀释液在平板表面涂抹均匀(见图7-4)。在涂抹时不要弄破平板,以免影响菌落的生长。翻转培养皿,置28℃~30℃条件下培养6~7d,观察放线菌菌落形态及计数菌落,并算出每g土壤中放线菌的数量(方法同上)。
⑤挑取单个菌落,接种于相应的斜面培养基上,如果不纯再移植或纯化,直至得到纯培养为止。
图7-3 吸管吸取菌液图7-4 平板涂抹操作
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3. 用平板划线法分离土壤中的细菌(土壤稀释液的制备同上)。
(1)每组取无菌培养皿两付,同上法在培养皿底部贴上标签。取已融化的牛肉膏蛋白胨培养基,倒入无菌培养血中,制成平板。
(2)平板凝固后,用接种环取相应的菌液一环(10-5或10-6)在平板上划线
①连续划线法:将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划法(图7-5),勿划破培养基。划线完毕后,倒置28oC~30oC温室培养。
②分区划线法:用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环,先在平板培养基的一边作第1次平行划线3-4条,再转动培养皿约60”角,并将接种环上剩余物烧掉,待冷却后通过第1次划线部分作第2次平行划线,再用同法通过第2次平行划线部分作第3次平行划线和通过第3次平行划线部分作第4次平行划线(见图7-5)划线完毕,盖上皿盖,倒置于28℃-30℃温室中培养。
(3)挑取单个菌落接种子斜面培养基上,如果不纯再移植成纯化,最后得到纯培养。
用上述分离土壤中真菌、放线菌和细菌的方法,也可用于分离病虫、病蚕或果蔬上的病原菌。以划线法从病蚕分离黑胸败血病病原菌为例,先用75%酒精棉球进行表面消毒(注意病虫、病蚕、果蔬等分离的样品不要过份腐烂,便于进行材料的处理。取灭菌手术剪剪去病蚕的一只腹足,流出体液作为划线分离的材料,若是分离苹果炭疽病病原菌,则用无菌镊子揭下有炭疽病苹果的果皮,再从此处切取米粒大小果皮1块,放入盛有1mL无菌水的试管中,用无菌玻棒捣碎制成悬浮液,划线法分离病原菌。
图7-5 平板分离划线的方法
A. 连续划线法B. 分区划线法
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(二)微生物的接种方法(示范)
(1)接种方法:常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、试管深层固体培养基的穿刺接种法等。
(2)接种工具见图7-6所示。
图7-6 常用的微生物接种工具
a. 接种环b. 玻璃括铲1. 塑料套2. 铝柄3. 镍铬丝4. 接种针5. 接种钩6. 接种环7. 接种圈8. 接种锄9. 三角形括铲10. 平括铲11. 移液管12. 滴管
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1. 斜面接种法
斜面接种方法及无菌操作过程如下具体操作过程见图7-7。
图7-7 斜面接种无菌操作示意图
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2. 液体接种法
包括从外面菌种接人培养液,或从液体菌种接入液体培养液,两种情况都可以用接种环接种。但在培养量比较大的情况下,液体接种宜采用移液管接种,同时要求无菌操作。
3. 穿刺接种法
用接种针经火焰灭菌,沾取少量菌种,垂直地穿入试管固体培养基中心至底部,然后沿着原接种线将针拔出,见图7-8。要做到手稳、动作轻巧快速,最后塞上棉塞。再将接种针上残留的菌体在火焰上烧掉。
图7-8 穿刺接种的2种方法
a. 垂直法b. 水平法
图7-9 厌氧培养罐图7-10 厌氧培养装置
1. 连接真空泵2. 隔板3. 吸氧剂
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)四大类微生物菌落形态的比较和识别
在分离和纯化微生物之前,首先必需对四大类微生物的菌落形态有正确的比较和识别,即细菌、酵母菌、放线菌和霉菌。熟悉和掌握这四大类微生物的形成特征对于菌种的筛选,杂菌的识别和菌种的识别都有很大用处。
区分和识别各大类微生物通常不外乎包括菌落形态(群体形态)和细胞形态(个体形成)等两方面的观察。细胞的形态构造是群体形态的基础,群体形态则是无数细胞形态的集中反映,故每一大类微生物都有一定的菌落特征,即它们在形态大小、色泽透明度、致密度和边缘等特征上都有所差异,一般根据这些差异就能识别大部分菌落。
四大类微生物菌落的基本特征可以从下面几占大概地把它们区分开来,更详细的可参考表7-1,作进一步的加以对照。
菌落形态 | |
细菌 | 菌落表面湿润,薄而小 |
酵母菌 | 菌落表面湿润,厚而大 |
放线菌 | 菌落表面干燥,密而小 |
霉菌 | 菌落表面干燥,松而大 |
四大类微生物的细胞形态: | |
细菌 | 小而分散 |
酵母菌 | 大而分散 |
放线菌 | 丝状较细 |
霉菌 | 丝状较粗 |
表7-1 细菌、放线菌、酵母菌和霉菌菌落形态比较