去年冬天
第1楼2011/06/01
3.1 菌种
敏感指示菌(大肠直菌)、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。
3.2 培养基
二倍肉膏蛋白胨培养液、上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基(含琼脂0.7%,试管分装,每管5mL)、下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基(含琼脂2%)、1%蛋白胨水培养基。
3.3 仪器和器具
无菌的试管、培养皿、三角瓶、移液管(1mL、5mL),恒温水浴锅,离心机、721分光光度计等。
噬菌体的检查5.1.1 样品采集将2~3g土样或5mL水样(职阴沟污水)放入灭菌三角瓶中,加入对数生长期的敏感指示菌(大肠杆菌)菌液3~5mL,再加20mL二倍肉汤蛋白胨培养液。5.1.2 增殖培养30℃振荡培养12~18h,使噬菌体增殖。5.1.3 离心分离将上述培养液以3000r/min离心15~20min,取上清液,和pH值7.0,1%蛋白胨水稀释至10-2~10-3,用于噬菌体检查及效价测定。5.1.4 生物测定法(1)双层琼脂平板法①倒下层琼脂:融化下层培养基,倒平板(约10mL/皿)待用。②倒上层琼脂:融化上层培养基,待融化的上层培养基冷却至50℃左右时,每管中加入敏感指示菌(大肠杆菌)菌液0.2mL,待检样品液或上述噬菌体增殖液0.2~0.5mL,混合后立即倒入上层平板铺平。③恒温培养:30℃恒温培养6~12h观察结果。④观察结果:如有噬菌体,则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑——噬菌斑。(2)单层琼脂平板法 省略下层培养基,将上层培养基的琼脂量增加至2%,融化后冷却至45℃左右,如同上法加入指示菌和检样,混合后迅速倒平板,30℃恒温培养6~16h后观察结果。5.1.5 离心分离加热法(快速检查)取大肠杆菌正常培养液和侵染有噬菌体的异常大肠杆菌培养液,4000r/min离心20min,分别取两组发酵液的上清液(A1),一部分于721分光光度计上测定OD650光密度值,另外各取5mL上清液于试管中,置水浴中煮沸2min(A2),检测A2溶液OD650光密度值,记录结果。
去年冬天
第2楼2011/06/01
噬菌体效价的测定
5.2.1 倒平板
将融化后冷却到45℃左右的下层肉膏蛋白胨固体培养基倾倒于11个无菌培养皿中,每皿约倾注10mL培养基,平放,待冷凝后在培养皿底部注明噬菌体稀释度。
5.2.2 稀释噬菌体
按10倍稀释法,吸取0.5mL大肠杆菌噬菌体,注入一支装有4.5mL 1%蛋白胨水的试管中,即稀释到10-1,依次稀释到10-6稀释度。
5.3 噬菌体与菌液混合
将11支灭菌空试管分别标记10-4,10-5,10-6和对照。分别从10-4,10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管中,每个稀释度平行做3个管,在另外2支对照管中加0.1mL无菌水,并分别于各管中加入0.2mL大肠杆菌菌悬液,振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀,置37℃水浴中保温5min,让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细菌。
5.4 接种上层平板
将11支融化并保温于45℃的上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基5mL分别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中,迅速摇匀,立即倒入相应编号的底层培养基平板表面,边倒入边摇动平板使其迅速地铺展表面。水平殖置,凝固后置37℃培养。
5.5 观察并计数
观察平板中的噬菌斑,并将结果记录于实验报告表格内,选取每皿有30~300个噬菌斑的平板计算呼菌体效价。计算公式:
N=Y/V·X