副溶血性弧菌PCR检测技术

(2)针对任意引物PCR 由于临床分离株绝大多数含有tdh基因，因此绝大部分研究者都根据tdh设计引物进行特异扩增。1993年，Lee等根据tdh基因设计引物，对36株TDH+株、89株TDH-株以及46株其他弧菌和肠道菌进行PCR检测。结果显示，36株TDH+株全部特异扩增出来，其余菌株都没有扩增；而检测灵敏度高，最低检测量可至40pgDNA，并可直接检测粪便标本，无需分离培养，方便快速。1999年，Kim等选择toxR基因序列设计两对引物，

5’--GTCTTCTGACGCAATCGTTG--3和 5’一ATACGAGTGGTTGCTGTCATG一3’，

对14株V．p、14株其他弧菌进行PCR。结果显示，14株V．p都得到一条368bp的特异扩增亮带，而其他菌株没有特异扩增。此外，Venkateswaran等选择gyrB基因设计引物对V·p进行PCR、Cordova等选择pR72H基因设计引物进行PCR，特异性、灵敏度都很好。



(3)多重PCR 由于不是全部副溶血性弧菌都含；tdh基因或，trh。基因，所以只针对tdh或trh的单一PCR，有时会漏检。多重PCR(multiplex-PCR)能全方位高效率地检测Vpo1994年，Bej白等针对“、tdh、trh设计不同的引物对，在同一PCR反应体系内同时扩增tl、tdh、trh。结果显示，所有的V。p都扩增出“基因，tl基因是V．p特异的；54％的V．p扩增出tdh基因；只有38．73％的V．p扩增出trh基因；该法灵敏度高，能把log牡蛎培养肉汤里10～100个V．p检测出来。与其他常规生化方法相比，多重PCR更快速，仅8h就能完成检测，结果更为准确、可靠，而且还可改进成定量竞争PCR，对标本中靶序列进行定量。

(4)实时PCR 常规PCR检测，需要从反应体系中吸取产物做电泳或Southern杂交等试验进行鉴定，转移过程中易污染，造成假阳性，而且耗费时间。1996年，Tyagi开创了一种实时PCR(Real-timePCP,)。实时PCR是在，PCR反应体系中加入标记有报告基团和淬灭基团的线性Taqman．探针或茎环型荧光分子信标探针，在墓因扩增过程中，与产物杂交，此时，报告基团和淬灭基团分开，根据能量共振转移现象，报告基团发出荧光而被检测。这种方法操作简单，闭管检测，减少污染，灵敏度高，并且可以在PCR结束或PCR过程进行同步定性或定量检测，面且可以进行临床大规模快速检测。


2003年，Blackstone等针对tdh设计荧光分子信标探针，对从牡蛎中富集的13个不同种类的菌株进行实时PCR检测。结果显示，只有含tdh的V．p才被检测出来，特异性好，灵敏度高，能把每个纯培养体系的1个CFU检测出来。实时PCR检测快速准确，但需要价格昂贵的荧光检测仪和荧光分子标记探针，一般的实验室不能广泛开展。分子信标实时PCR技术自1996年开创以来短短几年就得到蓬勃的发展，相信随着经济的发展、技术的进步、实时荧光检测仪的昔及，将会得到更为广泛的应用。