微生物限度检测法

灭菌后，冷至50℃左右倾入无菌平皿中，待凝固后冷藏备用。
4.4.2稀释剂及其制备方法：
4.4.2.1 0.9％无菌氯化钠溶液 取氯化钠9.0g，加水使溶解成1000ml，121℃灭菌20分钟。
4.4.2.2无菌吐温80－氯化钠溶液 取吐温80 1ml，加0.9％氯化钠溶液使成100ml,121℃灭菌20分钟。
4.4.2.3无菌磷酸盐缓冲液(pH7.2) 取磷酸氢二钠25.8g与磷酸二氢钠4.4g，加水稀释至 1000ml，121℃灭菌20分钟。
4.5供试品应随机抽样。如遇有异常或可疑的样品，须选取有疑义的样品。一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。供试品在检验前不得开启，在检查前及检查中应防止供试品污染菌受损、致死或繁殖。凡能从外观看出发霉、变质的样品，可直接判为不合格，无需再抽样检查。
4.6每批供试品检验量一般为10g 或10ml，供试品均须取自2 个以上的包装单位。检查的全部过程均应严格遵守无菌操作，严防再污染。
4.7除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25℃～28℃，控制菌培养温度为36±1℃ 。细菌、霉菌（酵母菌）计数和控制菌检查，均应作对照试验。检验结果的报告以1g、1ml或10cm2为单位（包装材料可以只、个为单位）。
4.8供试液的制备。
按供试品的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制成供试液。
4.8.1液体供试品 取供试品10ml，加入90ml稀释剂中，混匀，作为供试液。合剂（系指含王浆或蜂蜜者，下同）可用供试品作为供试液。
4.8.2固体、半固体或粘稠液 供试品称取供试品10g,置0.9％无菌氯化钠溶液100ml中，用匀浆仪或其它适宜方法，混匀后，作为供试液。在制备过程中，必要时可加适量吐温80，并适当加温，但不应超过45℃。
非水溶性供试品 称取供试品10g(10ml)，加入灭菌吐温80 30ml、灭菌液体石蜡10ml与0.9％无菌氯化钠溶60ml(或50ml)，同置匀浆仪中，乳化,或其它适发法乳化，作供试液。在制过程中，必要时可适当加温，但不应超过45℃。
4.8.3含抑菌成分供试品 供试品如干扰控制菌检验，按以下方法处理后，

依法检查。
4.8.3.1稀释法 将供试液种入较大量的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。
4.8.3.2离心沉淀集菌法 取规定量的供试液，离心(3000转)30分钟，弃去上清液，留底部集菌液约2ml ，再稀释成原规定量的供试液。如有不溶性药渣，可先离心(500转)5分钟，取全部上层液，再行集菌处理。
4.8.3.3薄膜过滤法 取规定量的供试液，置稀释剂100ml中,摇匀，以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45±0.02μm微孔滤膜的薄膜过滤器内，减压抽干后,用稀释剂冲洗滤膜3次，每次50～100ml，取出滤膜备检。
4.8.3.4中和法 凡含磺胺、汞、砷类或防腐剂的供试品，可用相应的试剂钝化活性因子，中和毒性后制成供试液。
4.9对照用菌液
控制菌检查均应作相应已知菌的对照试验。对照菌株为大肠杆菌[CMCC(B)44102]、沙门氏菌〔CMCC(B)50094〕、绿脓杆菌〔CMCC(B)10104〕及金黄色葡萄球菌〔CMCC(B) 26003〕。
取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳,接种至营养肉汤培养基内，培养18～20小时后，稀释至1:106。 对照菌的加入量为50～100 个。
4.10.细菌、霉菌与酵母菌计数
4.10.1平皿菌落计数法
4.10.1.1取均匀供试液,进一步稀释成1:102 、1:103等适宜的稀释度。分别取连续三级10倍稀释的供试液各1ml,置直径约90mm的平皿中，再注入约45℃的培养基约15ml，混匀，待凝固后，倒置培养，每稀释度应作2～3个平皿。
4.10.1.2细菌计数用营养琼脂培养基，霉菌计数用玫瑰红纳琼脂培养基，酵母菌计数用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，合剂用玫瑰红纳琼脂培养基与酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基。
4.10.1.3菌数测定空白对照试验 取供试液用的稀释剂各1ml，置4个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板、培养、检查，不得长菌。
4.10.1.4细菌培养时间为48小时,分别在24及48小时点计菌落数,一般以48小时菌落数为准。霉菌、酵母培养时间为72小时，分别在48及72小时点计

菌落数，一般以72小时菌落数为准。
4.10.1.5营养琼脂平板一般点计细菌菌落数，玫瑰红纳琼脂平板一般点计
霉菌菌落数，在特殊情况下，前者同时点计霉菌、酵母菌菌落数，后者同时点计细菌菌落数。酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂平板仅点计酵母菌菌落数。液体制剂同时点计霉菌菌落数及酵母菌菌落数。含蜂蜜及王浆的合剂的霉菌、酵母菌菌落数分别测定，合并计数。菌落如蔓延生长成片，不宜计数。点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。
4.10.1.6菌数报告规则 细菌宜选取平均菌落数在30～300之间的稀释级,霉菌宜选取平均菌落数在30～100之间的稀释级作为报告菌数计算的依据。如有1个稀释级在30～300(30～100)之间时,将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有2个稀释级在30～300(30～100)之间时，按下式计算两级比值。
高稀释级的平均菌落数×稀释倍数
比值＝────────────────
低稀释级的平均菌落数×稀释倍数
当比值≤2时，以两稀释级的均值报告，当比值＞2时，以低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有3个稀释级的平均菌落数均在30～300之间时,以后2个稀释级计算级间比值报告；如各稀释级的平均菌落数均不在30～300之间，以最接近30或300的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在300(100)以上，按最高稀释级菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均小于30时，一般按最低稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告。如当1:10（或1:100 ）稀释级平均菌落数等于或大于原液（或1:10稀释级）时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数。
4.10.2培养基稀释法 取供试液（原液或1:10供试液）3份，每份各1ml,分别注入5个平皿内（每皿各0.2ml）。每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，计数。每1ml注入的5个平板点计的菌落数之和，即为每1ml的菌落数，共得3组据。以3份供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。如各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于1时,则报告菌数为小于10个。
4.11控制菌检查 除另有规定外，取供试液10ml(相当供试品1g、1ml 、

10cm2),直接或处理后接种，经增菌分离培养后，进行革兰氏染色、生化试验与血清凝集试验项检查。
4.11.1 大肠杆菌(Escherichia coli) 取胆盐乳糖培养基3份，每份各100ml,2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释剂作空白对照。培养18～24小时（必要可延至48小时）。空白对照应无菌生长。其余2份培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板,培养18～24小时。当阳性对照的平板呈阳性菌落时,供试品的平板无菌落生长,或有菌落但不同于表1所列的特征,可判为未检出大肠杆菌。
表 1 大肠杆菌菌落形态特征
培 养 基    菌 落 形 态
曙红亚甲蓝琼脂    呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽。
麦 康 凯 琼 脂    鲜桃红色或微红色，菌落中心深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。
如生长的菌落与表1所列特征相符或疑似者,应挑选2～3个菌落分别接种于营养琼脂培养基斜面，培养18小时，作以下检查：
4.11.1.1革兰氏染色 取上述斜面培养物，涂片，固定。以结晶紫染液染色1分钟,水洗，革兰氏碘液媒染1分钟，水洗，滤纸吸干余水。以乙醇脱色20～30秒钟,水洗。滴加沙黄染液复染1分钟，待干后镜检。
4.11.1.2乳糖发酵试验 取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养24～48小时，观察产酸（培养基变色），产气（杜氏管内有气泡）。
4.11.1.3靛基质试验 取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基中，培养48±2小时,沿管壁加入对靛基质试液0.3～0.5ml，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。
4.11.1.4甲基红试验 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中,培养48±2小时，于每1ml培养液中加入甲基红指示剂1滴，立即观察，呈

鲜红色或桔红色为阳性，呈黄色为阴性。
4.11.1.5乙酰甲基甲醇生成试验（V-P 试验） 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基，培养48±2小时，于每2ml培养液中加入α-萘酚乙醇液1ml，混匀，再加40％氢氧化钾溶液0.4ml，充分振摇，出现红色为阳性。加试剂4小时内，如出现红色亦应判为阳性，无红色反应为阴性。
4.11.1.6枸橼酸盐利用试验 取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基的斜面上，培养48±2小时,培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变时为阴性。
当空白对照试验呈阴性，供试品检查为革兰氏阴性无芽孢杆菌；乳糖发酵产酸产气或产酸不产气；IMViC 试验为阳性、阳性、阴性、阴性或阴性、阳性、阴性、阴性，判为检出大肠杆菌。对可疑反应的菌株，应重新分离培养后，再作生化试验证实。
4.11.2绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa) 取胆盐乳糖培养基3份，每份各100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作为阳性对照,第3份加入与供试液等量的稀释剂作空白对照。培养18～24小时，空白对照应无菌生长,其余2份培养液划线接种于十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基平板上，培养18～24小时。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板无菌落或无疑似菌落生长，可判为未检出绿脓杆菌。
绿脓杆菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散，表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿色素扩散。如生长菌落具有上述特征或疑似者，应挑选2～3个菌落，分别接种营养琼脂培养基斜面上，培养18～24小时，取培养物革兰氏染色，并作氧化酶试验。
4.11.2.1氧化酶试验 取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻璃棒取营养琼脂培养基斜面培养物涂于滤纸片上，再滴加新配制的1％二甲基对苯二胺盐酸盐试液,在30秒内呈粉红色逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性。否则为阴性。
如证实为非革兰氏阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均可判为未检出绿脓杆菌。否则，应进行绿脓菌素试验。
4.11.2.2绿脓菌素(Pyocyanin) 试验 取上述琼脂斜面培养物，接种于绿脓菌素测定用培养基斜面上，培养24小时后，在试管内加氯仿3～5ml,搅碎培

养基并充分振摇。静置片刻,将氯仿移至另一试管中，加入1mol/L盐酸溶液约1ml,振摇后，静置片刻，如在盐酸溶液层内出现粉红色，即为绿脓菌素阳性。试验同时应有空白对照试验。
当空白对照试验呈阴性时，供试品检查为革兰氏阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素阳性、可判定为检出绿脓杆菌。
绿脓菌素阴性的培养物，应继续以下试验。
4.11.2.3硝酸盐还原产气试验 取营养琼脂培养基斜面培养物,接种于硝酸盐胨水培养基中,培养24小时，如在培养基的杜氏管中有气体产生，即为阳性。
4.11.2.4 42℃生长试验 营养琼脂培养基斜面培养物于0.9％无菌氯化钠溶液中,制成菌悬液,再将菌悬液接种于营养琼脂培养基斜面上，立即置41±1℃水浴中培养24～48小时,有菌苔生长者为阳性；否则为阴性。
4.11.2.5明胶液化试验 以接种针沾取营养琼脂培养基斜面培养物，穿刺于明胶培养基内，培养24小时，取出置冰箱内10～30分钟。如培养基仍呈溶液状，为阳性。
当革兰氏阴性杆菌，氧化酶试验阳性，绿脓菌素试验为阴性，其硝酸盐还原产气试验、42℃生长试验及明胶液化试验均为阳性时，应判为检查绿脓杆菌。
4.11.3金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 取亚碲酸钠肉汤（或营养肉汤）培养基3份，每份各100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作为阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释剂作为空白对照。均培养18～24小时(必要时可延至48小时)。空白对照应无菌生长。取其余2份培养液划线接种于卵黄高盐琼脂培养基平板上或甘露醇高盐琼脂培养基平板上，培养24～72小时。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板如无菌落生长，或有菌落但不同于表4所列特征,可判为未检出金黄色葡萄球菌。
表2 金黄色葡萄球菌菌落形态特征
培 养 基    菌 落 形 态
卵黄高盐琼脂    金黄色、圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径1～2mm
甘露醇高盐琼脂    金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄色环，菌落直径约0.7～1mm

如有菌落生长并与表4所列特征相符或疑似时,应挑选2～3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18～24小时，取其培养物革兰氏染色，并作血浆凝固酶试验。
4.11.3.1血浆凝固酶试验 取灭菌小试管3支，各加入血浆①－无菌水(1:1)0.5ml，1支加入被检菌株的营养肉汤培养液（或浓菌悬液）0.5ml,其余2支作对照管；1支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作阳性对照;另1支加入营养肉汤或0.9％氯化钠溶0.5ml作空白对照。将3管同时培养。3小时后开始检查,以后适当时间逐次观察直至24小时。空白对照管的血浆流动自如，阳性对照管血浆凝固，试验管血浆凝固者为阳性；阳性对照管和空白对照管任何一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验。
4.11.3.2当空白对照和阳性对照符合要求，供试品的菌株为革兰氏阳性球菌、血浆凝固酶试验阳性，判定为检出金黄色葡萄球菌。
4.12结果判断
4.12.1细菌菌落数、霉菌（酵母菌）菌落数、控制菌三项均符合该品种微生物限度项下规定，应判供试品合格；其中任何一项不符合该品种项下规定，应判供试品不合格。
4.12.2细菌菌落数、霉菌(酵母菌)菌落数第一次测定超过该品种项下微生物限度规定时，应从同一批号样品中随机抽样，复试两次，以三次结果平均值报告。
4.12.3如发现营养琼脂培养基平板生长霉菌（酵母菌）菌落数或虎红琼脂培养基平板上生长细菌菌落数超过该品种项下微生物限度规定时，应判为供试品不合格。
4.12.4各类样品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再抽样复试，即应判该供试品不合格。