积分，还是积分——冰凉连载中（以示本帖一点也不火爆）

happy王子矜

2011/10/13

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积分，还是积分

本文去年就在筹划，因为种种原因，一直未能成文，实在愧对极限色谱版面版主的职位，以至于我都不好意思跟小S他们打招呼。谨以此文作为对极限色谱版和月旭公司对本人的信任的感谢，所以谢绝其他网站和个人的转载。版权所有，谢谢合作。

在色谱检测中，几乎所有的结果都由积分得来，不管是峰面积还是峰高定量，积分参数的调整都会带来对最终结果或多或少的影响。如何正确积分是一个色谱工作者必须掌握的技能，然而在实际工作中，因为色谱图的千奇百怪，因为积分算法的多种多样，因为积分参数的复杂变化，迄今还未见到有文章或资料能对此做出比较合理的操作方式和令人信服的解释。给出一套令人信服的积分操作SOP几乎是一件不可能完成的任务，但是实际状况又确实需要这样一个东西，来解除大家工作中的疑惑，使不同实验室不同单位之间色谱数据的交流更加有效合理。

作为色谱工作者的一员，我也在热切期盼中，苦苦等到现在，我认为，虽然这是一个我无法建立起来的高楼大厦，但是我可以尽自己的力量去添加一砖一瓦，哪怕我自己盖的小茅屋经不起一阵风，我至少可以给后来人看到它如何倒下。

Q1为什么要积分？

色谱发展史大部分人都比较了解，但是色谱定量的历史很少有相关资料。按照本人的猜想，最初的记录仪就像我们在电视上常见的地震记录一样，热敏纸，指针抖啊抖的，划出来一张色谱图，数据处理什么的想也别想，要想知道含量？可以，自己拿尺子量去！也许这就是以前以峰高定量方式采用比较多的原因？毕竟量个峰高比量半峰宽什么的方便简单。估计是大家钢板尺瞅的眼睛也花了，而且XX大会召开，为了确保安全，钢板尺这样的凶器也要实名购买，十分不便。所以后来就有了数据处理机。现在还有很多实验室有这个东西，当然现在用的最古董处理最麻烦的型号拿到以前电脑技术没发展的时候，也能让N多诺贝尔化学奖得主感动的泪流满面。说到底，还是技术的进步带来的数据计算处理的方便，大家不再满足于峰高的定量，因为峰高定量受限很多，只有很完美的峰型出现的偏差才较小。

解释1，峰高定量的缺陷。

峰高和峰面积定量的基本区别（受各种参数制约，不一定完美线性展现，但是普遍规律是有的）

浓度型检测器，流速降低，峰面积增加，峰高不变；（代表检测器UV）
质量型检测器，流速降低，峰面积不变，峰高降低。（代表检测器FID）

书摘：

“辛格提出，如果色谱峰比较对称，相对于峰面积，峰高受色谱峰重叠的影响比较小。
“Meyer认为，轻微重叠的色谱峰，用峰高定量是更安全的选择。

书摘：
“峰高的线性范围比峰面积窄；
“再者，峰高是峰宽的函数。因此还与柱效有关，不仅仅和待测物质的量有关系。

书摘：
“积分仪的使用，使得‘测量比较容易’不再被考虑。（显然指的是手工测量）
“不同次测量的误差，意味着分析过程没有被良好的控制。在这一方面，峰面积比峰高更为灵敏。（峰面积包含两个参量，峰高和峰宽）

书摘：
“选择峰高或峰面积要考虑的因素：
噪声：
噪声对峰面积的影响比峰高大。（影响蜂起点终点的位置确定）
信噪比比较差的时候，峰高优先考虑

对称度：
不对称的色谱峰，峰面积更加准确。

重叠峰：
重叠峰可能会干扰峰高和峰面积。但除非（就两个峰来说）某一个峰的最高点在另一峰以内，峰高不受影响。

基线漂移：
基线漂移的时候，峰切割对峰高的影响要小。
峰高定量的线性范围比峰面积要小。
即便发生信号刚刚超出线性范围，峰面积的偏离也比峰高要小。

检测器类型：
浓度型检测器，如果流速不是很稳定，用峰高定量比较好。
检测器滤波常数：检测器滤波常数过大会降低峰高，峰面积不变。

上面的内容比较碎，我们以紫外检测器举例说明吧，如果把HPLC的紫外检测器当成一个紫外分光光度计，那么我们得到的就不会是一张色谱图，而是每个样品对应的一个吸光度的点（一维信息），和浓度数据一起放在坐标体系内，x，y轴分别是浓度和吸光度，然后根据朗伯比尔定律计算样品的纯度。在色谱系统中，紫外检测器的数据会多一维的信息，那就是时间。液相的紫外检测器是不间断扫描提取结果，样品在色谱柱经过分离后，以时间为坐标与杂质或其它响应区别开来，于是有了二维的色谱图。x轴是时间，y轴依然是吸光度。跟一维的坐标体系相比，我们可以这样理解：x轴依然是浓度，但是每个时间△t点上的浓度。峰面积定量比峰高定量就多了这么一点要求：峰型完美的高斯峰。一个是铺平在桌面上看大小，一个竖起来从坐标轴的y轴看高低。打个比方，要测量wangzijin和kaikaifeng的质量比值，但是没有秤，只有一把尺子，怎么办呢？峰高定量法就是测量一下这两人的身高，然后得出结论，wangzijin：kaikaifeng=X：Y。如果这俩人宽度相宜厚度相当，那么这个结果是比较靠谱的；峰面积定量法就是把俩人铺在桌子上（汗，扑街的感觉），测量头部的宽度，肩膀的宽度，等等，然后计算，如果这俩人厚度差不多，那么这个结果也是比较靠谱的。

PS：细心的板油肯定注意到了，即使这样定量依然不是完美的，因为wangzijin和kaikaifeng同学俩人的厚度没参与计算，其实这正说明我举例子的严肃性，任何定量方法都不是完美的，只能说峰面积定量与峰高定量相比有很大优势。即使引进了DAD,MS检测器，得到更多一维的数据，把厚度算上，实际的结果仍然会有差异，因为wangzijin和kaikaifeng的密度啊什么的也不一致，会带来误差。

综上，峰面积定量比峰高有很大的优势，限制小，信息量大，但是峰面积从哪里来呢？——积分来的，看吧，说了这么多，终于进入正题了，前面都没积分什么事儿。

Q2积分如何影响结果？

要研究这个问题，首先要知道算法。这些算法都是手动计算时期留下的宝贵遗产，要说明我们的结果，了解这些还是必须的。基本的算法有以下几种：

1，峰高X半高峰宽法

其实就是三角形底边X高/2，选取的底边就是峰的起点和终点的连线。

2，三角形切线法

就是拐点做切线，然后计算这个三角形的面积，跟方法1的区别就是底边选取的是切线出来的三角形的底边，而不是直接用的峰起点终点连线。据说近似等于峰高0.607处的峰宽X2.

以上适用于对称峰型。

3，峰高X峰宽的平均值法

这里适用于不对称峰，外观上看就是把三角形的峰面积公式换成了梯形面积计算公式。选取峰高0.15处的峰宽为上底边，选取峰高0.85处的峰宽为下底边。但是我们计算的不是这中间的梯形的峰面积，所以公式里面的峰高不是（0.85-0.15=0.6）倍的峰高，而是全峰高。

4，分割计算后加合法

不参考梯形面积计算方式，而是把不对称的峰分割成几小块计算。

以上适用于不对称峰型

再以上一下，方法1-4都说的是基线良好，分离良好的单个峰的面积计算，然后我们的重点来了，基线漂移，分离不太好的俩峰或是几个峰如何计算峰面积？

其实算法还是前面的算法，不过峰高发生了变化。

5&6，竖直向下法和垂直于基线法

竖直向下法就是从峰顶点作时间轴（t）的垂线，然后用峰顶点和垂线与基线的交接处的连线当高；垂直于基线法就是从峰顶点作基线的垂线，以此做高。从三角形的面积计算来说，垂直于基线法显然更加准确，但是色谱峰毕竟不是规整的三角形，所以哪个方法更加准确会受峰型的影响，不能想当然的以为。对于漂移不大，或者峰比较窄的时候，采用竖直向下法，对于基线漂移比较大，峰宽比较大的峰面积，采用垂直于基线法。如此选择并不是基于什么明显的公式推导，而是大量实际计算和数学统计得出的结论。所以道理是没有的，但服从还是必须的。

特别说明：这里说的基线漂移，可以是本底吸收的漂移，也可以是大峰拖尾或前沿引起的漂移。所以说，遇到大峰尾巴上的小峰，“切线积分”是必须的，也就是说，峰起点和终点都应该在吸光度曲线而不是虚拟的背景基线上。同样的，道理是没有的，服从是必须的。这是大量计算统计的结果。关于这些内容，后面会详细的说，这里就此带过。

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