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UPLC-MSMS检测水中的微囊藻毒素LR

阳光海岸

2011/11/17

液质联用（LCMS）

1 引言

1.1 概述

微囊藻毒素(Microcystin)是一种篮绿藻毒素，由蓝绿藻水华所引起。由于它能产生环状七肽肝毒素，可致家畜死亡和人类肝中毒。WHO规定它在水环境中的指标值为1ug/L，中国在2002年发布的《地表水环境质量标准》(GB3838-2002)中的特定项目标准限值亦规定为1ug/L Microcystin-LR。Microcystin-LR是微囊藻毒素中的一种。由于它分子量大、极性强，非常适合LC/MS检测。

1.2 测定方法

水样冻融1-3次，破碎藻细胞，解冻后用0.2um滤膜(或双层0.45um滤膜)过滤，进样5.00mL用On-line SPE-UPLC-MSMS测定Microcystin-LR总量。以C18 UPLC专用色谱柱，0.5%甲酸/1%甲醇溶液和0.5%甲酸/90:10乙腈甲醇为流动相，用在线固相萃取-超高校液相色谱-质谱检测器(On-line SPE-UPLC-MSMS)测定microcystin-LR的色谱峰。用外标法计算含量。

1.3 干扰

在水样中凡能被固相萃取柱萃取的化合物都有可能造成干扰。水样在储存和萃取过程中，蓝藻的细胞破裂可释放毒素，会造成水中溶解的毒素含量增高。另外，要防止高浓度到低浓度的交叉污染。

1.4 水样的储存

微囊藻毒素在常温下容易生物降解，在有余氯时容易被氧化降解，所以水样采集后应尽快萃取，有余氯的水样需要用硫代硫酸衲脱氯。水样采集在1L的棕色玻璃瓶中。若水样采集后确实不能马上处理，则把水样用玻璃滤纸过滤，处理水加80mg的脱氯剂，储存于4^oC的冰箱中。

1.5 测定范围

原水和处理水中可溶解的和总的微囊藻毒素Microcystin-LR。

2 仪器
2.1 Waters ACQUITY UPLC H-Class QSM
2.2 Waters ACQUITY UPLC H-Class BSM
2.3 Waters ACQUITY UPLC TQ Detector (ESI)
2.4 2777高压样品管理器含Waters Online SPE system
2.5 Waters ACQUITY UPLC 色谱注加热器/冷却器
2.6 Waters ACQUITY BEH C18 1.7um，2.1×50mm色谱柱
On-line Extraction Column Oasis HLB 20um ，2.1×30mm Column
2.7 样品过滤装置，GF/C glass filter， 0.2um GV(Millipore)萃取液过滤膜
2.8 注射针：250uL，5.00mL。小体积容量瓶，23.0ml。
3 试剂
3.1 微囊藻毒素固体标准或微囊藻毒素溶液标准(10.0mg/L，购于SIGMA公司)
Microcystin-LR固体标准0.500mg(C49H74N10O12, MW=995.2)购于SIGMA公司。

3.2 微囊藻毒素储存标准（10.0mg/L）
用甲醇溶解0.500mg Microcystin-LR于50ml容量瓶中。

3.3 微囊藻毒素标准系列
a) 1000ug/L Microcystin-LR和50.0ug/L Microcystin-LR中间液。
用250uL 注射针取200ul 浓度为10mg/L Microcystin-LR，用甲醇定容至2.00ml容量瓶中为1000ug/L Microcystin-LR。用250uL 注射针取100ul 浓度为1000ug/L Microcystin-LR，用甲醇定容至2.00ml容量瓶中为50.0ug/L Microcystin-LR。
b) 0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500 ug/L Microcystin-LR标准系列：用注射针分别取25、50.0、100、150、200、250uL浓度为100ug/L Microcystin-LR标准溶液，用纯水定容至25.0mL容量瓶中。

3.4 甲醇和乙腈为HPLC级，MERKER公司。

3.5 配制的溶液： BSM-A1用甲醇， BSM-B2用乙腈
3.5.1 0.5%甲酸/1%甲醇水溶液：用移液管吸5mL甲酸(MERKER公司)和10mL甲醇至980-990mL纯水中。BSM-A2 and QSM-B用
3.5.2 0.5%甲酸/90:10乙腈甲醇溶液：用移液管吸5mL甲酸(MERKER公司) 于900mL乙腈，加入100mL甲醇混匀。BSM-B1 and QSM-C用
3.5.3 2%氨水/1%甲醇水溶液：用量筒取71mL氨水(MERKER公司)和10mL甲醇至920ml纯水中。QSM-A用
3.5.4 50:50/甲醇丙酮溶液：用量筒分别取500mL甲醇和丙酮混匀。QSM-D用
3.5.5 10%甲醇水溶液：用量筒取50mL甲醇至500ml纯水中。弱洗针液用
3.5.6 50%甲醇水溶液：用量筒取250mL甲醇至500ml纯水中。强洗针液用
3.5.7 10%甲醇水溶液：用量筒取100mL甲醇至1000ml纯水中。Prime sealwash用，5%甲醇亦可。

3.6 N2，99.9%

4 操作步骤
4.1 色谱条件
色谱柱：Waters ACQUITY BEH C18 1.7um，2.1×50mm
SPE柱：On-line Extraction Column Oasis HLB，20um 2.1×30mm
流动相：0.5%甲酸/1%甲醇水溶液 / 0.5%甲酸/90:10乙腈甲醇溶液
流速：0.2mL/min
柱温：35oC
注射体积：5.00mL

4.1.1梯度洗脱程序：SPE_System Mic-LR2011 略
4.2 质谱条件： SPE_MS_20110531 Mic-LR
Source (ESI+)
电离方式：ESI(positive)
电离电压(Capillary)：2.9kV
锥孔电压(Cone)：75V (Microcystin-RR:40V, Microcystin-YR (下次定)and Microcystin-LR:75V)
Extractor：3V
RF Lens：0.3V
离子源温度(Source Temp)：110oC
去溶剂温度(Cone Temp)：400oC
去溶剂气流量(Desolvation Gas Flow)：300L/Hr
锥孔气流量(Cone Gas Flow)：40L/Hr
LM Resolution：15
HM Resolution：15
Ion Energy：0.4
MS 模式：MSMS
Entrance：0
Collision：70
Exit：0
LM Resolution：15
HM Resolution：15
Ion Energy： 0.5
Gain：1.00
Collision Gas：0.2mL/min

Edit MS Method
Type：MRM of 2 mass paris ，单离子995.7>135.2定量，
双离子995.7>135.2、995.7>107.1定性。
Ion Mode：ES+
Span(Da)：0.1
Inter-Channel Delay：-1.000
Interscan Delay：-1.000
Span：0.1
Start Time(Min) 0.0
End Time(Min) 11.0
Use Tune Cone Voltage
Use Tune Collsion Energy

4.3 标准曲线的制作（外标法）
标准曲线在7.18分钟左右出峰，标准样品的色谱图和质谱图见图1和图2。分别进样5.0mL浓度为0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500 ug/L的标准系列，以浓度和峰面积制作标准曲线。

4.4 样品分析
4.4.1 水样的处理
用125mL聚乙烯瓶取水样100 mL水样。
水源水放入-30℃冰箱冻8小时以上，然后水流中解冻至实温。这样的冻融过程持续1-3次即可。用GF/C玻璃滤膜加0.2um滤膜(或双层0.45um滤膜)过滤。若是处理水，加20mg硫代硫酸钠脱氯，最好过滤。过滤后的水样储存于23m L样品瓶中。
（源水水样不冻融检测得到的结果是溶解性的Microcystin-LR。）

4.4.2 萃取样的分析
用与标准样品相同的色谱条件对萃取样进行LC-MS分析。

5 计算
根据标准曲线和水样的峰面积计算水样的浓度

6 检出限
a) 仪器的定量检出下限大约为0.01ug/L，见图3，图中的信噪比为50(0.005ug/L)。
b) 若以0.01ug/L测试，测定的回收率介于109%-132% 之间。0.005/L测定的回收率介于106%-176% 之间,超出了50%-150% 的要求，所以定量检出下限定为0.01ug/L。

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happy爱米粒

第6楼2011/11/17

怎么是繁体啊，楼主改成中文简体，再上点图片，加点数据就可以参加原创了

0

Longer

第7楼2011/11/17

挺好的应用和实验条件，做得挺细致全面。

0

阳光海岸

第8楼2011/11/18

回复6楼，我已经改为简体字了。我的电脑是公司电脑，发文件和图片不被允许，所以没有色谱图等！望见谅！

0

小猪飞飞

第9楼2011/11/18

我可以做到0.001ug/L，当然前处理需要富集一下，取样量要比楼主大些。想问下，楼主说在常温下容易降解，在余氯的情况下容易氧化。请问降解、氧化后的产物一样吗？毒性增强了还是减弱了？有没有做过这方面的研究。

0

阳光海岸

第11楼2011/11/18

回复小猪飞飞：
我的检测是在线固相萃取Online SPE，进样体积5mL，检出限本来可以做更低，如果按色谱要求信噪比3定义检出限，我的检出限可以达到0.0003ug/L。如果定义定量下限信噪比为20我的定量下限可以是0.002ug/L。
但是为了使自己的定量浓度可靠，我按照美国的定量下限浓度的回收率达到50-150%来定义的，所以做的定量下限浓度比较高为0.01ug/L。
Mic-LR常温会分解，和Cl2会氧化它，产物本人未做研究。但是用Elisa可以确认的是毒性降低了很多很多！
望各位朋友见谅！

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