水产品中硝基呋喃类代谢物测定法的简易改进
洪波1、黄向荣2
1 湖南省水产科学研究所 长沙 410153
2 农业部渔业产品质量监督检验测试中心(长沙) 长沙 410153
呋喃类药物抗菌谱较广, 5-10ppm即能抑制多种革兰氏阳性和阴性菌,20-50 ppm有杀菌作用,对某些原虫、真菌亦有一定作用。日前,关于水产养殖中使用硝基呋喃药物的报道愈来愈多。此类药物进入食物链后对人体造成伤害,其人体不良反映主要是胃肠反应、溶血性贫血、血小板减少性紫癜、多发性神经炎(一般认为呋喃唑酮毒性较小, 如剂量超过0. 4 g/ d 或总量超过3.0 g 易引起神经炎) 、眼部损害、急性肝坏死和嗜酸性白细胞增多为特征的过敏反应。
通常用高效液相色谱结合紫外检测器和高效液相色谱配合质谱技术(LC/MS)测定硝基呋喃类代谢物在动物组织中的残留,笔者在HPLC定性定量的简便、快速、准确的方法基础上进行了方法的研究改进。
1 实验部分
1. 1 仪器与试剂
岛津LC–20A高效液相色谱仪,配紫外检测器;旋转蒸发器(上海亚荣化仪器厂);高速冷冻离心机﹙德国HEMEL公司﹚;PHS一3C精密pH 计(上海雷磁仪器厂) ;数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司) ;乙腈、甲醇、乙酸乙酯、异丙醇为色谱纯;庚烷磺酸钠、冰乙酸均为优级纯;盐酸、氢氧化钠为分析纯;C18–CN柱500mg/6ml﹙安捷伦公司﹚;呋喃它定、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮为Sigma 公司提供(纯度> 99 %) 。
1.2 色谱条件
Inertsil ODS- 3 色谱柱(5μm, 250 ×4. 6 mm) ; 流动相: 甲醇+乙酸乙酯+异丙醇+冰乙酸+0.05%庚烷磺酸钠溶液﹙5+5+9+0.1+81﹚; 恒流速1. 0 mL/ min ; 柱温: 35℃;紫外检测波长280 nm;进样量50μL;外标法定量。
1.3 标准溶液的配制
准确称取一定量的标准品, 用少量甲醇溶解后, 再用甲醇定容为100 ug/mL 的储备液, 再以甲醇稀释成标准工作液。
1.4 实验方法
1.4.1 提取
准确称取已捣碎的样品10g,置于50离心管中,加入5g提取剂1及10ml提取剂2,超声漩涡混匀后35℃超声20min,6000r/min离心10min,取出上清液于另一支50ml离心管中,再加10ml提取剂2,重复提取一遍,合并提取液。
1.4.2 衍生化
在提取液中,加入衍生化试剂0.5ml混匀后,于45℃超声40min,取出冷却至室温。
1.4.3 萃取
用氢氧化钠调Ph值至7.0~7.5,加入10ml乙酸乙酯萃取,5000r/min离心5min后,取上层液体于鸡心瓶中,再加入10ml乙酸乙酯,重复提取一次,合并提取液于35℃减压蒸发至干,加入5%的甲醇溶液6ml,分两次溶解洗涤。
1.4.4 净化
先将净化柱一次用8ml甲醇、8ml水活化,待加入样液过柱后用10ml水淋洗,抽干,用10ml甲醇洗脱,转移至50ml鸡心瓶中40℃减压旋转蒸发至干,残渣用1.0ml 30%乙腈以及2ml异辛烷溶解,振荡混匀,6000r/min离心10min,取下层乙腈水溶液过0.22um微孔滤膜,供高效液相色谱使用。
2 结果与讨论
2. 1 色谱条件的优化
在HPLC 色谱条件下,分别对文献报道的几种流动相组成和pH值试验; InertsilODS-2/-3和Wondsil–C18 色谱柱; 275、280、380nm紫外检测波长等进行实验条件的优化,最后选择条件Inertsil ODS- 3 色谱柱(5μm, 250 ×4. 6 mm) ;流动相: 甲醇+乙酸乙酯+异丙醇+冰乙酸+0.05%庚烷磺酸钠溶液﹙5+5+9+0.1+81﹚;流速1. 0 mL/ min ; 柱温: 35℃;紫外检测波长280nm;进样量50μL。优化色谱条件下的标准溶液、样品加标、的色谱图分别见图1。
2. 2 标准工作曲线
按照实验条件和方法, 在系列样品中进行系列浓度的加标回收, 经测定4 种硝基呋喃药物在1~100μg/ kg 的范围内有良好的线性关系, 相关系数分别为0. 9988 以上, 符合仪器分析方法的要求。
2. 3 方法的检出限
在本实验操作条件下,据3倍噪音的峰响应值、称样量和进样量, 计算出呋喃它定、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮的检出限分别为5、2、3、2μg/ kg。
2. 4 SPE 对回收率的影响及柱活化
分别选用Oasis HLB 、Sep-PakC18-CN萃取柱, 以及C18-CN柱填料量60/500/1000mg进行比较,发现 SPE 使杂峰的干扰较少, 操作简便、快速、灵敏,
2. 5 回收率与精密度
我们在鸡肉、鱼肉、虾肉系列样品中, 分别以10、20、50μg/ kg 的加标, 在本实验方法和条件下, 测定其3 种样品在3 个不同浓度水平的加标回收率、精密度。阳性样品、阴性样品的测试结果见表1。
组分 | 加标量 (ug/Kg) | 回收量 (ug/Kg) | 回收率 (%) | 变异系数 (%) |
AOZ | 10.0 20.0 50.0 | 7.54 16.92 42.05 | 75.4 84.6 84.1 | 7.86 4.25 2.84 |
AMOZ | 10.0 20.0 50.0 | 7.68 16.80 42.50 | 76.8 84.0 85.0 | 7.11 2.34 3.56 |
AHD | 10.0 20.0 50.0 | 6.78 15.32 40.57 | 67.8 76.6 81.1 | 5.53 7.54 4.14 |
SEM | 10.0 20.0 50.0 | 7.28 15.02 39.52 | 72.8 75.0 79.0 | 5.23 4.31 4.33 |