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液相色谱法检测黄曲霉毒素M1操作规程

北京泰乐祺

2012/01/05

液相色谱（LC）

针对近期奶中出现的黄曲霉毒素M1超标问题快速解决方案。

1. 仪器

1.1 高效液相色谱仪配荧光检测器

1.2 震荡器（或高速搅拌器）

1.3 高速离心机

2. 试剂与试液

2.1 色谱甲醇

2.2 蒸馏水

2.3 乙腈+水（25+75）

2.4 石油醚

2.5 10%乙腈

2.6 氢氧化钠溶液（0.5mol/L）

玻璃纤维滤纸（PriboFast免疫亲和柱免费赠送）

3. 测定法

本法系用高效液相色谱法（GB/T18980-2003）测定牛奶，奶粉等产品中的黄曲霉毒素M1，除另有规定外，按下列方法测定。

3.1色谱条件

色谱柱：C18柱，150×4.6mm，5um

检测器：荧光检测器；激发波长365nm，发射波长435nm；

流动相：乙腈-水（25：75）

流速：1.0ml/min

进样量：20ul

柱温：室温

3.2 标准品溶液的配制

取黄曲霉毒素M1标准品，用乙腈稀释成0.5ug/ml的标准储备液。根据使用需要，准确吸取10μl、20μl、50μl、100μl、200μl的黄曲霉毒素标准储备液，置5ml的容量瓶中，用流动相稀释至刻度，配成相当于1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的标准工作液，即得。

3.3 样品前处理

3.3.1牛奶

将100mL牛奶水浴加热至40℃；

4000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用；

3.3.2乳粉和粉状婴幼儿配方食品

称取10g奶粉样品，将100mL50℃水多次少量加入，搅拌，使奶粉充分溶解；

6000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用；

3.3.3发酵乳(包括固体状、半固体状和带果肉型)

称取60 g混匀的试样，用0.5mol/L 的氢氧化钠溶液在酸度计指示下调pH至7.4；

用高速均质器在 9500 转/分钟，高速匀浆5 min

水浴加热至40℃；

4000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用

3.3.4干酪

称取经切细、过10目圆孔筛混匀的试样5g置于50 mL离心管中，加2 mL水和30mL甲醇；

用高速均质器在 9500r/分钟，高速匀浆5 min；

超声提取30 min；

在6000r/分钟下离心15 min，收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。

在分液漏斗中加入30 mL石油醚，振摇2 min；

待分层后，将下层移于50 mL烧杯中，弃去石油醚层。

重复用石油醚提取2次；。

将下层溶液移到100 mL圆底烧瓶中，减压浓缩至约2 mL；

浓缩液倒入离心管中，烧瓶用乙腈-水溶液(1+4) 5 mL分2次洗涤，洗涤液一并倒入50 mL离心管中；

加水稀释至约50 mL，在6000 转/分钟下离心 5 min，上清液供净化处理。

3.3.5奶油

称取5g试样，置于50 mL烧杯中；

用20 mL石油醚将其溶解并移于250mL具塞锥形瓶中。

加20 mL水和30 mL甲醇，振荡30 min后，将全部液体移于分液漏斗中；

待分层后，将下层溶液全部移到100 mL圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪中减压浓缩至约5 mL，加水稀释至约50mL，供净化处理。

3.4 供试品溶液的制备

3.4.1 PriboFast^® 黄曲霉毒素M1免疫亲和柱的操作

将免疫亲和柱连接于50.0mL玻璃注射器下。准确移取50.0mL净化溶液注入玻璃注射器；

将空气压力泵与注射器连接，调节压力使溶液以约2-3mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2～3mL空气通过柱体；

更换10ml注射器与亲和柱连接，在注射器中加入10ml水，调节压力使水以约6mL/min流速清洗亲和柱。

准确加入4mL色谱级乙腈洗脱，流速为1 mL/min～2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。（建议将乙腈的量分2-4次加入。每次加入后，要让甲醇充分浸泡柱子里的凝胶2分钟。洗脱后的乙腈溶液，最好是水浴30℃加热吹近干。用10%乙腈定容后上液相）

3.5 测定

精密量取1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的标准工作液各20ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。另精密量取供试品溶液20ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素M1的量，计算，即得。

1.本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。

2.残留有黄曲霉毒素M1的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器（装有10%氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。

分
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有水有渝

第1楼2012/01/05

应助达人

这是照搬标准，还是真的操作规程？

0

cxq19871003

第2楼2012/01/05

这是北京一个公司的原文吧？我看过！

0

zhaohua8011

第3楼2012/01/05

应该是标准的，罗列的这么详细！值得参考！

0

rapid666

第4楼2012/01/08

这个不是照抄的标准,我们使用了他们的免疫亲和柱,按照这个方法做的,是他们实验室参考国标开发的,值得参考!

0

ahciqhx

第5楼2012/01/10

现行的GB国家食品安全标准写的就很好的，有多种方法。而且是强制性标准，应该要用的。

0

happy爱米粒

第6楼2012/01/10

呵呵，原来是宣传亲和柱的，别的柱子试过吗？
rapid666(rapid666) 发表:这个不是照抄的标准,我们使用了他们的免疫亲和柱,按照这个方法做的,是他们实验室参考国标开发的,值得参考!

0

happy爱米粒

第7楼2012/01/10

灵敏度能达到多少？准确度怎样？

0

小虾米

第8楼2012/08/05

有没有做过系统的考察？

0

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