省部重点实验室
第1楼2012/03/03
qPCR中的P代表什么?Polymerase,聚合酶。如果qPCR少了聚合酶,你一定觉得这是在开玩笑,巧妇难为无米之炊,没有聚合酶,定量PCR还怎么做。
一直以来,研究人员在尝试创造自我复制的酶。实现这个目标的方法之一是用RNA酶来催化RNA分子的复制,包括RNA酶本身。这已经通过交叉催化(cross-catalytic)系统来实现了,它包括两个RNA酶,它们能利用四种底物成分来催化彼此的合成。
“R3C”就是一种能自我复制的RNA酶,但不是从核苷酸到核苷酸,而是通过碱基配对将两个RNA核苷酸连在一起。但是,这个过程效率很低,因为底物形成了无生产力的复合物,限制了指数级的增长,而倍增时间长达17小时。美国斯克里普斯研究所(Scripps Research Institute)的Gerald Joyce和他的同事就一直在研究并改进“R3C”连接酶。
他们将R3C转变成交叉催化的形式,在那里正链酶将两个RNA分子组合起来,产生非常相似的负链酶,这个负链酶反过来又连接两个底物,形成正链酶。随后,Joyce他们利用体外演化(in vitro evolution)来改善这种RNA酶的催化性质。在他们的努力下,当加入新鲜的寡核苷酸和镁离子之后,这些酶能够在42°C的恒温下以指数方式自我扩增,倍增时间缩短至1小时。
Joyce认为:“这种复制品的最大应用是它是分子事件的信号放大器。”他指的是将催化结构域和配体结合结构域(适体,aptamer)结合起来,产生“适酶(apatazyme)”,这样扩增就成为配体依赖型。在配体存在时,适体序列是有序的,“适酶”的催化结构域也是,从而实现了指数级的扩增。但是当缺乏适当的配体时,整个分子就变得不稳定,连接酶活性也丧失。RNA的指数增长率取决于配体的浓度,这就能确定样品中配体的浓度。这个过程与定量PCR是相似的,但是适用性更广。多种目标都受用,包括与诊断和环境监测相关的蛋白和小分子。
随着适体开发成为一种常规的方法,该系统能用于检测从蛋白到代谢物的所有分子。同时,研究人员也在对适酶系统进行改进,Joyce认为一年内倍增时间将缩短至10分钟。根据这种分子的动力学特性,他认为1分钟也是完全可行的。
省部重点实验室
第2楼2012/03/03
问:什么是QPCR?
答:QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统,也叫实
时定量基因扩增荧光检测系统,简称QPCR。
问:QPCR、DNA检测、PCR之间的关系?
答:聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction简称PCR)原理凭借敏感、特异、快速的特点荣获93年诺贝尔化学奖。因其在病原体检测方面的独特优势,因而发达国家在相关方法和仪器方面的研发非常快,成为分子生物学诊断的主流,至今仍处于学术和应用前沿:
第一代产品:
基因扩增热循环仪(DNA Thermal Cycler)+电泳仪+紫外分析仪+定性试剂,构成PCR定性检测。
第二代产品:
基因扩增热循环仪+荧光仪+终点定量试剂,构成PCR-DNA终点法定量检测(End-point quantitative PCR detection),又分为终点酶免定量( End-point ELISA-PCR)和终点荧光定量(End-point Fluor-PCR)两种。
第三代产品:
实时定量QPCR仪+实时荧光定量试剂,构成QPCR-DAN/RNA实时荧光定量检测。
问:相比以前的方法,QPCR有哪些特点?
答:QPCR至少有以下特点:
所用仪器少,只用一台仪器。
检测时间短,只须45分钟~1小时10分钟(试剂各异),而定性PCR须3~4小时,酶免终点定量须6~8小时,荧光终点定量须2~3小时。
操作极其简单:前处理后,样本插入仪器一小时后到电脑上来出报告即可,无须开盖,移样本(以前方法),避免污染。
结果精确:定性PCR只能定性,很粗略,终点定量PCR由于只能在40个热循环结束后检测荧光,被测荧光达到饱和导致定量不够精确,属于半定量状态。而实时荧光QPCR是在扩增的每时每刻连续检测各样本的荧光值的变化。
检测动态范围:10~10000000000 DNA copies/ml
检测精度:0.1RLU
辨别率:5000和10,000个模板拷贝样本的辨别率99.7%。
问:QPCR的技术先进性、价格及应用现状?
答:实时荧光QPCR是当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术,被美国FDA承认并推崇,被美国FDA批准并取得临床应用执照的QPCR试剂品种有:
HBV乙肝病毒DNA,HCV丙肝病毒RNA,HIV艾滋病病毒RNA,Chlamydi trachomatis(CT),性传播疾病,沙眼衣原体,Neiserria gonorrhea(NG),性传播疾病,淋病双球菌,Cytomegalovirus(CMV),性传播疾病,巨细胞病毒,Mybobacterium tuberculosis(Mtb),呼吸道疾病,结核分支杆菌等。
实时荧光PCR仪研发技术难度大,门槛高,发达国家也只有有限几家知名公司生产,且售价昂贵:如
美国ABI/7700-120万元,美国ABI/5700-50万元,瑞士Roche/Lightcycler-70万元,美国Stratagene公司2005年新品MX3005P-80万元
可见,在病人看来,哪家医院应用了QPCR技术便是先进诊断技术的象征,在发达国家也是如此。
国产仪器情况:国产仪器生产单位不超过五家,其中包括:
日本独资杭州博日实时荧光QPCR仪(33孔)
西安天隆科技有限公司TL988实时荧光QPCR仪(48孔)
以上产品均取得国家SFDA认证,报价均在45万以上。
国产试剂情况:
多家公司生产实时荧光QPCR试剂盒,价格与终点法试剂相当,且品种齐全,价格便宜,购买方便:
乙肝HBV-DNA,丙肝HCV-RNA,艾滋AIDSHIV-RNA,性病系列:淋病双球菌NG、沙眼衣原体CT、解脲支原体UU、疱疹病毒HSV、人体乳头瘤HPV,优生优育系列:巨细胞病毒CMV、弓形虫COX等。