省部重点实验室
第1楼2012/03/03
【操作步骤】
1.PCR测序反应
(1) 取0.2ml的PCR管,用记号笔编号,将管插在颗粒冰中,按下表加试剂:
所加试剂 测定模板管 标准对照管
BigDye Mix 1μl 1μl
待测的质粒DNA 1μl -
pGEM-3Zf (+)双链DNA - 1μl
待测DNA的正向引物 1μl -
M13(-21)引物 - 1μl
灭菌去离子水 2μl 2μl
总反应体积5μl,不加轻矿物油或石蜡油,盖紧PCR管,用手指弹管混匀,稍离心。
(2) 将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2min后进行PCR循环,PCR循环参数为96℃10s,50℃5s,60℃4min,25个循环,扩增结束后设置4℃保温。
2.醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物
(1) 将混合物离心,将扩增产物转移到1.5ml EP管中。
(2) 加入25μl醋酸钠/乙醇混合液,充分振荡,置冰上10min以沉淀DNA。12000r/min于4℃离心30min,小心弃上清。
(3) 加70%(V/V)的乙醇50μl洗涤沉淀2次。12000r/min于4℃离心5min,小心弃上清和管壁的液珠,真空干燥沉淀10~15min。
3.电泳前测序PCR产物的处理
(1) 加入12μl的TSR于离心管中,剧烈振荡,让其充分溶解DNA沉淀,稍离心。
(2) 将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR管中,稍离心。
(3) 在PCR仪上进行热变性(95℃2min),冰中骤冷,待上机。
4.上机操作
按仪器操作说明书安装毛细管,进行毛细管位置的校正,人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管,1.2kV预电泳5min,按编程次序自动进样,再预电泳(1.2kV,20min),在7.5kV下电泳2h。电泳结束后仪器会自动清洗,灌胶,进下一样品,预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h。电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。
5.仪器将自动进行序列分析,并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知,可通过序列比较以星号标出差异碱基处,提高工作效率。
6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。
【计算】
测序反应精确度计算公式:100%-差异碱基数(不包括N数)/650×100%
差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基,N为仪器不能辨读的碱基。
【注意事项与评价】
1.ABI PRISM 310基因分析仪是高档精密仪器,需专人操作、管理和维护。
2.本实验测序PCR反应的总体积是5μl,而且未加矿物油覆盖,所以PCR管盖的密封性很重要,除加完试剂后盖紧PCR管盖外,最好选用PE公司的PCR管。如PCR结束后PCR液小于4~4.5μl,则此PCR反应可能失败,不必进行纯化和上样。
3.作为测序用户来说,只需提供纯化好的DNA样品和引物,一个测序PCR反应使用的模板不同,需要的DNA量也就不同,PCR测序所需模板的量较少,一般PCR产物需30~90ng,单链DNA需50~100ng,双链DNA需200~500ng,DNA的纯度一般是A260nm/A280nm为1.6~2.0,最好用去离子水或三蒸水溶解DNA,不用TE缓冲液溶解。引物用去离子水或三蒸水配成3.2pmol/μl较好。
4.本实验使用的测序试剂盒是BigDye荧光标记终止底物循环测序试剂盒,一般可测DNA长度为650bp左右。本仪器DNA测序精确度为(98.5±0.5)%,仪器不能辨读的碱基N<2%,所需测定的长度超过了650bp,则需设计另外的引物。为保证测序更为准确,可设计反向引物对同一模板进行测序,相互印证。对于N碱基可进行人工核对,有时可以辨读出来。为提高测序的精确度,根据星号提示位置,可人工分析该处彩色图谱,对该处碱基作进一步核对。
省部重点实验室
第2楼2012/03/03
第三代测序技术简介 转自sciencenet 作者 廖新化 如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA,并用它来测序,你一定会认为他异想天开,没有一点生物的sense。 我最初就是这样认为的,然而它不仅可以实现,而且已经实现了!这个就是被称为第三代的测序技术,Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time (SMRT™ DNA Sequencing”(单分子实时DNA测序)。 我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座,根据自己粗浅的理解记录整理一下。 要实现单分子实时测序,有三个关键的技术。 第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。显微镜现在再厉害,也不可能真的实时看到“单分子”。但是它可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候,它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候,它的荧光基团就被DNA聚合酶切除,荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性,并且在荧光被切除之后,合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。 第二个是纳米微孔。因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候,DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)],单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。在这么小的孔内,DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限,而且由于A,T,C,G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去,它们形成了非常稳定的背景荧光信号。而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时,这种特定颜色的荧光会持续一小段时间,直到新的化学键形成,荧光基团被DNA聚合酶切除为止(见图)。 第三个是共聚焦显微镜实时地快速地对集成在板上的无数的纳米小孔同时进行记录。由于我对显微原理的物理知识匮乏,而Pacific Biosciences公司又没有非常强调在这方面的发明,不做进一步探讨。 他们还对这一技术进行进一步的优化。 第一个是把双链DNA环化反复测序。人们可以在双链DNA的两头连上发夹结构的DNA adaptor,从而使DNA环化。而DNA聚合酶就能够以环化的DNA作为模板滚环复制,反复测一段DNA序列。这种反复测序,纠正了偶尔出现的复制错误,从而使测序精度非常高。 第二个是激发光中断测序法。DNA聚合酶虽然很稳定,但是在强大的激发光作用下酶也是有一定寿命的。如果把激发光中断一段时间,在这段时间内DNA聚合酶继续复制DNA,当激发光重新开启以后,人们就可以测到长DNA链后面的序列。 第三代测序技术非常可怕。1、它实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度,一秒可以测10个碱基,测序速度是化学法测序的2万倍。2、它实现了DNA聚合酶内在自身的processivity(延续性,也就是DNA聚合酶一次可以合成很长的片段),一个反应就可以测非常长的序列。 二代测序现在可以测到上百个碱基,但是三代测序现在就可以测几千个碱基。这为基因组的重复序列的拼接提供了非常好的条件。3、它的精度非常高,达到99.9999%。 此外,它还有两个应用是二代测序所不具备的。 第一个是直接测RNA的序列。既然DNA聚合酶能够实时观测,那么以RNA为模板复制DNA的逆转录酶也同样可以。RNA的直接测序,将大大降低体外逆转录产生的系统误差。 第二个是直接测甲基化的DNA序列。实际上DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基化的C为模板,DNA聚合酶停顿的时间不同。根据这个不同的时间,可以判断模板的C是否甲基化。 Pacific Biosciences公司预计2010年或者2011年就会推出商业化的测序仪器。在不远的将来,如果他们能和二代测序一样集成100万个纳米微孔,那么一台仪器15分钟就能够准确地测出一个人的基因组。以后每个人的基因组测序成本将变成100美元,人人都可以消费得起。想想人类基因组计划耗资30亿美元,费时十几年,无数科学家参与其中,技术的革新意义是多么重大啊! 介绍完三代测序技术之后,请允许我贩卖点私货: 1、创新创新再创新。国内多数导师为了掩饰自己idea的匮乏,极力压制学生的冒险欲望,鼓励学生对一个小的问题花无数的时间用data堆成文章。其实想做真正有挑战性的课题的想法是非常可贵的,导师一个很重要的功能是帮助学生评估他们想法的可行性,在可行的情况下尽量提供条件让他们自己去闯。从想做真正科研的学生的角度来说,让那些不能激动你的保险课题见鬼去吧,花大力气去寻找一些真正能贡献科学,贡献社会的课题,不要害怕一时的挫折,这是科研的真意! 2、不要鄙视公司。有很多人以为学院派的科研是最好的,其实真正推动科学进步的绝不仅仅是发生在学校和研究所的科研。公司同样能做非常令人晕眩的研究,经济意义,社会效益有时候恐怕远甚于学院派研究。美国的许多应用研究就是在公司里面完成的。 3、学科交叉。紧咬你的可贵想法,然后横跨各个学科,自己学或者寻合作者。光是生物背景,想要发明第三代测序技术,那就是个笑话。 Next-generation DNA sequencing methods.pdf 779.88 KB, 下载次数: 940 The impact of next-generation sequencing technology on genetics.pdf 846.03 KB, 下载次数: 925 Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules.pdf 963.33 KB, 下载次数: 755 Single molecule measurement of the “speed limit” of DNA polymerase.pdf 579.81 KB, 下载次数: 460 Single-molecule sequencing of an individual human genome.pdf 803.7 KB, 下载次数: 464 |
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第5楼2014/12/14