提问帖（4.19）：C18色谱柱使用的日常注意事项有哪些呢？

C18色谱柱是指色谱柱的填料为18烷基键合硅胶，填料的类型决定了这是一个反相色谱柱，用于分离极性较大的物质。在C18色谱柱使用时需要注意的事项，如下:
　　1.使用自动进样器时，有时因进样阀操作缓慢，可能在柱入口造成较大的压力变化。
　　2.切勿将C18色谱柱的使用摔落地下或与硬物相撞击，因为C18色谱柱的使用在受到冲击后，使用时可能会发生峰开裂。
　　3.出现压力升高或峰开裂，原因可能是柱入口的过滤片堵塞或已污染。
　　4.色谱柱使用的流动相pH范围为pH2～8。为防止柱性能降低，注意流动相PH值不要超出此范围。
　　5.C18色谱柱的使用是用高压浆液状装填的，具有高的耐压性。但为了长期保持其良好的性能，请在20MPa以下使用。请注意剧烈的压力变化

在日常分离分析工作中，色谱柱使用是否得当，直接影响色谱柱的寿命。下面介绍C18柱在日常使用过程中应注意的事项。
　　(1)柱子在装卸、更换时，动作要轻，接头拧紧要适度。必须防止较强的机械振动，以免柱床产生空隙。
(2)如果仪器用来做常规分析，样品种类有限，但分析次数多，则不妨为每一类常规分析配置1根专用柱，这样有助于延长柱子的寿命。
(3)如使用柱温控制装置时，应注意在通入流动相后才能升温。
(4)流动相使用前需进行脱气处理，以免降低柱效和影响检测等。样品溶液需经适当的前处理及过滤，以减少柱污染和堵塞。
(5)在更换流动相种类时，应注意溶剂的互溶性，防止发生盐析现象。
(6)柱子的实际操作压力应低于填装时的最高压力，最好在最高压力一半以下。一般不超过20 593.965～29 419.95 kPa。在低压力(≤14 709.975 kPa)的范围使用，可使柱保持长时期的高柱效。
(7)C18色谱柱属非极性键合相色谱柱，流动相的pH值应严格控制在2～7之间，以免损坏柱子。
(8)在完成分离分析工作之后，不应立即停机，需及时对色谱分析系统进行冲洗，一般0.5 h以上，以除去色谱柱内的杂质。
(9)如果流动相中有盐类，首先用水充分清洗。如果是胺类(如三甲胺类或四丁基胺类)添加到流动相中，要用50%甲醇和0.05%磷酸溶液混合溶剂冲洗，不要只用水冲洗。
(10)C18一般用100%甲醇作为保存溶剂，以防柱子干裂而损坏。严禁水或缓冲溶液长时间在色谱流路中保留。
(11)选用合适的C18保护柱，以保护分析柱免受杂质颗粒及不可逆吸附的干扰物的影响。保护柱内装填料颗粒度应与分析柱填料的颗粒度尽量一致。
(12)柱的保存期不宜太长。短期不用的C18柱，用甲醇冲洗30～60 min，然后将柱两端密封。较长期不用的柱子，一是采取定期冲洗，再密封的方法；二是在冲洗后，柱两端各装1只有一定容量的灌满甲醇的容器(只装一端也可)，以补充在较长存放期间柱内溶剂的蒸发。
3　C18色谱柱的维修
　　色谱柱在日常使用过程中，尽管保护严格，样品和流动相尽管经过前处理，但经过长时间的使用，仍然难以完全避免柱子受到污染，固定相流失、板结、柱床塌陷以及柱效下降等。有些可以通过维修，使部分柱效恢复。
3.1　柱污染再生技术　色谱柱污染后，可以用合适的溶剂冲洗，使柱效再生。C18柱常规的再生洗涤方法是：分别用甲醇、三氯甲烷、甲醇/水各60 mL依次通过色谱柱，再用100%甲醇60 mL平衡色谱柱后封存，柱效将恢复正常。必要时，根据柱污染性质(如有机污染、盐类污染等)，采用0.05 mol/L H2SO4、0.5 mol/L H3PO4或0.1 mol/L EDTA钠盐冲洗，然后再用水冲洗，最后用100%甲醇平衡色谱柱后封存。对于严重污染的C18柱，可采用水、甲醇、氯仿、乙烷依次冲洗后，按顺序倒过来再冲洗1次，每次所用溶剂60 mL，不接检测器，最后用100%甲醇平衡色谱柱封存。
3.2　柱污染的修复　在柱污染再生无效或已知柱污染严重时，可以采用柱修补的方法解决，但柱污染深度不宜超过5 mm。方法是将特制小铲将污染部分挖去，再用与柱填料相同的固定相与流动相混合制成浆状，然后将浆状固定相仔细补入被挖去的部分(尽量使后填补的固定相接近原装的紧密程度)，修平端面即可。修好的柱子如果柱头两端的筛板的孔径是一致的，可将柱子颠倒过来使用一般时间，目的是借助流动相冲洗作用，恢复柱床紧密程度。
3.3　柱塌陷的修复　柱塌陷的原因很多。对于塌陷不太严重时，如果柱头两端的筛板孔径是一致的，可将柱颠倒使用一般时间，即可恢复性能。当塌陷严重(5 mm左右)时，可采用柱污染的修复方法修补即可。

A 色谱柱验收
检查外观是否完好；
检查柱子的规格型号，是否与您的需求相符；
如果您想对新色谱柱的性能进行测试，可以按照柱性能测试报告上的条件进行测试。

B 色谱柱安装
该色谱柱与外径为1/16英寸的PEEK管线或不锈钢管线完美匹配；
为减小死体积，柱前和柱后的管线内径应不超过0.01 英寸(0.25 mm)；
如果您使用的是PEEK管线，您应选择PEEK接头使管线与色谱柱连接；如果您使用的是不锈钢管线，您可以选择PEEK接头或不锈钢接头，当使用不锈钢接头时，应确保管线与柱头紧密结合后再固定韧环，这样可以防止管线与色谱柱连接处产生死体积。

C 对流动相的要求
该反相色谱柱，可以使用水或有机溶剂作为流动相，并且为了特殊需要还可以在流动相中加入酸、碱、盐；
该色谱柱不能耐受纯水或纯水溶液，流动相中有机相的比例不应低于5%；
该色谱柱的pH值耐受范围为1.5-9.0，流动相的pH值不应超过这一范围，否则色谱柱性能和寿命会受到影响；
对于缓和流动相，应确保不同溶剂间的良好互容，以免影响分析结果；
对于有机溶剂-缓冲溶液体系，应确保缓冲盐不会析出；
不同流动相的黏度有差别，使用不同的流动相时，色谱柱产生的压强会有差别；使用水(包括缓冲溶液)-乙腈体系时，乙腈含量为20%时产生的压强最大；使用水(包括缓冲溶液)-甲醇体系时，甲醇含量为50%时产生的压强最大；Diamonsil 2的最高承受压强远高于反相模式下可能产生的最高压强；
在10-40 °C之间，使用较高的柱温能够降低色谱柱压强并改善分离效果；
用于流动相配制的溶剂应为HPLC级或更高级别，作为添加物的酸、碱、盐尽量使用HPLC级别；
色谱柱入口和出口安装了2 μm筛板，为避免色谱柱堵塞，流动相应经0.45 μm滤膜或孔径更小的滤膜过滤；
流动相应该有效脱气后再使用，以避免在系统中产生气泡导致的泵和检测器不稳定；
纯水或缓冲盐水溶液易滋生微生物造成流动相污染，纯水或缓冲盐水溶液作为流动相组分时，24小时内应更换新的溶液。

D 转换流动相的注意事项
您收到的色谱柱是保存在65%乙腈水溶液中的，使用前建议您用甲醇或乙腈对新色谱柱进行活化冲洗；
纯有机溶剂或有机溶剂含量较高的流动相与含缓冲盐的流动相变换，不应直接替换，两者之间应使用10%甲醇水溶液或10%乙腈水溶液进行过渡，过渡溶剂体积不少于10倍柱体积；
用某一种流动相代替上一种流动相时，应确保两者互容；

E 色谱柱保存
超过24小时的时间不使用色谱柱，最好将色谱柱保存在乙腈或甲醇中；
操作时的流动相中若无酸、碱、盐，可以用乙腈或甲醇冲洗20倍柱体积后直接封存；操作时的流动相中若有酸、碱、盐，应先用10%甲醇水溶液或10%乙腈水溶液冲洗20倍柱体积，然后再用乙腈或甲醇冲洗，然后封存；
使用随色谱柱一起的PEEK螺旋塞将色谱柱的入口和出口密封，以防止柱中溶剂挥发。

F 对样品的要求
用于进样的样品溶液须经0.45 μm滤膜或孔径更小的滤膜过滤
如果样品提取自复杂基质(比如动植物基质)，最好对提取液进行适当的纯化处理，以避免污染色谱柱，影响分析效果和色谱柱寿命
安装保护柱可以防止颗粒物堵塞色谱柱，并预先吸附强保留物质，以避免其污染色谱柱。

G 色谱柱再生方法
当色谱柱压强明显升高时可对色谱柱进行再生处理；用相当于20倍柱体积的溶剂按下列次序冲洗色谱柱：10％甲醇水溶液→甲醇→异丙醇→甲醇。该程序适用于反相色谱柱：C18, C8, PH, CN。如果色谱柱的压力升高是由颗粒杂质堵塞引起，再生处理效果不明显。

柱床体积计算方法：V=3.14*d2*L/4

d为色谱柱内径，单位为cm；L为柱长，单位为cm。

色谱柱规格 150 mm*4.6 mm 200 mm*4.6 mm 250 mm*4.6 mm
柱床体积 2.5 ml 3.3 ml 4.2 ml

应助达人

(1)柱子在装卸、更换时，动作要轻，接头拧紧要适度。必须防止较强的机械振动，以免柱床产生空隙。
(2)如果仪器用来做常规分析，样品种类有限，但分析次数多，则不妨为每一类常规分析配置1根专用柱，这样有助于延长柱子的寿命。
(3)如使用柱温控制装置时，应注意在通入流动相后才能升温。
(4)流动相使用前需进行脱气处理，以免降低柱效和影响检测等。样品溶液需经适当的前处理及过滤，以减少柱污染和堵塞。
(5)在更换流动相种类时，应注意溶剂的互溶性，防止发生盐析现象。
(6)柱子的实际操作压力应低于填装时的最高压力，最好在最高压力一半以下。一般不超过20 593.965～29 419.95 kPa。在低压力(≤14 709.975 kPa)的范围使用，可使柱保持长时期的高柱效。
(7)C18色谱柱属非极性键合相色谱柱，流动相的pH值应严格控制在2～7之间，以免损坏柱子。
(8)在完成分离分析工作之后，不应立即停机，需及时对色谱分析系统进行冲洗，一般0.5 h以上，以除去色谱柱内的杂质。
(9)如果流动相中有盐类，首先用水充分清洗。如果是胺类(如三甲胺类或四丁基胺类)添加到流动相中，要用50%甲醇和0.05%磷酸溶液混合溶剂冲洗，不要只用水冲洗。
(10)C18一般用100%甲醇作为保存溶剂，以防柱子干裂而损坏。严禁水或缓冲溶液长时间在色谱流路中保留。
(11)选用合适的C18保护柱，以保护分析柱免受杂质颗粒及不可逆吸附的干扰物的影响。保护柱内装填料颗粒度应与分析柱填料的颗粒度尽量一致。
(12)柱的保存期不宜太长。短期不用的C18柱，用甲醇冲洗30～60 min，然后将柱两端密封。较长期不用的柱子，一是采取定期冲洗，再密封的方法；二是在冲洗后，柱两端各装1只有一定容量的灌满甲醇的容器(只装一端也可)，以补充在较长存放期间柱内溶剂的蒸发。

应助达人

色谱柱的使用寿命，除了与所分析的样品和流动相及使用频率有关系外，最主要的是与日常维护有关。色谱柱的使用寿命主要是柱效和柱压两个指标来衡量，如果一支色谱柱柱效太低或柱压太高，通常被认为该色谱柱已经报费。因此，延长色谱柱使用寿命的关键是，消除引起柱效下降和柱压升高的因素。日常维护注意事项：

（1）流动相的ph值应有使用范围内：由于流动相的ph 控制不当而对色谱柱造成的损害，通常很难是色谱柱恢复，因此必须认真对待，严格控制流动相的ph值。

（2）去除样品和流动相中的固体颗粒：样品和流动相中含有的固体颗粒物质会堵塞色谱柱筛板，筛板被堵住不仅会引起柱压的升高，而且也会引起柱效下降，因为筛板的堵塞会引起液流不均，导致色谱峰型拖尾、变宽，从而使柱效下降。因此，建议使用超纯水和色谱纯试剂，在分析样品前对样品进行针筒过滤，流动相过0.45μm滤膜。

（3）使用保护柱或在线过滤器：样品和流动相经过滤后并不能完全消除固体颗粒物质，因为泵的磨损、密封圈和管路的老化也会产生固体颗粒物质，这些固体颗粒被流动相带入色谱柱，堵塞筛板，导致柱压升高、柱效下降。保护柱和在线过滤器上都有筛板，其孔径与色谱柱孔径相同，因此可以阻止固体颗粒物质到达色谱柱，有效防止色谱柱筛板的堵塞。由于柱压升高在分析故障中占很大比例，因此，除对样品和流动相进行过滤外，建议您在色谱柱进样端加上保护柱或在线过滤器。

（4）正确使用缓冲盐：缓冲盐通常易溶于水，难溶于有机溶剂，因此缓冲盐使用不当会使其析出，堵塞填料基质上的微孔和颗粒间的空隙，使填料板结，柱压上升；同时阻碍了基质上键合的碳链自由舒展，使色谱柱的保留能力下降，柱效降低。缓冲盐析出后，去除非常困难，因此，正确的使用缓冲盐对延长色谱柱使用寿命非常重要。正确使用缓冲盐的方法可归结为一句话：使用前要过滤，使用后要冲洗。

（5）防止强保留物质在色谱柱上存留：强保留物质和大分子化合物在色谱柱中累积，对样品中的化合物产生额外的保留行为，不仅引起峰型变宽、拖尾，使柱效下降，同时也会引起保留时间的变化，累积到一定程度时还会导致柱压升高。由于强保留物质和大分子化合物对色谱分离的影响是一个累积效应，需要一定的时间才会体现出来，但对许多药品特别是复杂样品而言，很难判断其是否是含有强保留物质

应助达人

色谱柱的使用寿命，除了与所分析的样品和流动相及使用频率有关外，最主要的是与日常的维护密切相关。色谱柱的使用寿命主要是根据柱效和柱压两个指标来衡量，如果一支色谱柱柱效太低或柱压太高，通常被认为该色谱柱的使用寿命已经结束。因此，延长色谱柱使用寿命的关键是，消除引起柱效下降和柱压升高的因素。以下是色谱柱的日常维护方法：
　　一. 流动相的pH应在使用范围内
　　Welch公司的色谱柱除反相氰基柱pH1.5~9.0外，其它反相色谱柱的pH范围均为1.5～10，由于填料中存在Si-C和Si-O键，流动相超过其pH范围将会导致硅胶基质流失和键合相碳链断裂，使柱效下降，使用寿命变短。由于流动相的pH控制不当而对色谱柱造成的损害，通常很难使色谱柱恢复，因此必须认真对待，严格控制流动相的pH值。
　　二. 去除样品和流动相中的固体颗粒
　　样品和流动相中含有的固体颗粒物质会堵塞色谱柱筛板，筛板被堵不仅会引起柱压的升高，而且也会引起柱效下降，因为筛板的堵塞会引起液流不均，导致色谱峰形拖尾、变宽，从而使柱效下降。因此，建议使用超纯水和色谱纯试剂，在分析前对样品进行针筒过滤，流动相过0.45um滤膜。
　　三. 使用保护柱或在线过滤器
　　样品和流动相经过滤后并不能完全消除固体颗粒物质，因为泵的磨损、密封圈和管路的老化也会产生固体颗粒物质，这些固体颗粒被流动相带入色谱柱，堵塞筛板，导致柱压升高、柱效下降。保护柱和在线过滤器上都有筛板，其孔径与色谱柱筛板孔径相同，因此可以阻止固体颗粒物质到达色谱柱，有效防止色谱柱筛板的堵塞。由于柱压升高在分析故障中占很大比例，因此，除对样品和流动相进行过滤外，建议您在色谱柱进样端加上保护柱或在线过滤器。
　　如果确认色谱柱柱压升高是由于进样端筛板被堵引起的，可选择以下方式进行补救：
　　1. 先在色谱柱前加上保护柱或在线过滤器，然后用甲醇/水=20/80 1.0ml/min
　　反向冲洗色谱柱180min。
　　2. 先在色谱柱进样端加上保护柱或在线过滤器，然后反向使用。
　　四. 正确使用缓冲盐
　　缓冲盐通常易溶于水，难溶于有机溶剂，因此缓冲盐使用不当会使其析出，堵塞填料基质上的微孔和颗粒间的空隙，使填料板结，柱压上升;同时阻碍了基质上键合的碳链自由舒展，使色谱柱的保留能力下降，柱效降低。缓冲盐析出后，去除非常困难，因此，正确的使用缓冲盐对延长色谱柱使用寿命非常重要。
　　正确使用缓冲盐的目的是防止缓冲盐析出，因此正确使用缓冲盐的方法可归结为一句话：使用前要过渡，使用后要冲洗。具体方法如下：
　　1. 等度条件：使用缓冲盐前需用过渡流动相以1.0ml/min流速冲洗30min，
　　使用后去除缓冲盐的另一个方法是用过渡流动相以0.2ml/min流速冲洗
　　色谱柱过夜。
　　2. 梯度条件：用含有缓冲盐的流动相跑梯度之前，用与初始流动相组成相同的过渡流动相以1.0ml/min流速冲洗30min;分析完成后，再用该过渡流动相以1.0ml/min冲洗色谱柱45min。含缓冲盐流动相的梯度设定应尽量平缓，以避免梯度过程中缓冲盐析出。
　　注意：过渡流动相是指有机相和水相的组成与分析流动相相同，区别只是过渡流动相中不含缓冲盐。
　　3. 缓冲盐析出的补救方法：
　　1)方案1：用甲醇/水=20/80以1.0ml/min流速35℃条件下反向冲洗色谱柱120min;
　　2)方案2：用甲醇/水=20/80以0.2ml/min流速反向冲洗色谱柱过夜。
　　五. 防止强保留物质在色谱柱中存留
　　强保留物质和大分子化合物在色谱柱中累积，对样品中的化合物产生额外的保留行为，不仅引起峰形变宽、拖尾，使柱效下降，同时也会引起保留时间的变化，累积到一定程度时还会导致柱压升高。由于强保留物质和大分子化合物对色谱分离的影响是一个累积效应，需要一定的时间才会体现出来，但对许多样品特别是复杂样品而言，很难判断其是否含有强保留物质，因此要防止强保留物质的累积，需要在每天的日常维护中用纯甲醇或乙腈清洗色谱柱。
　　清洗方法：
　　1. 未使用缓冲盐：每天分析完成后，用纯甲醇或纯乙腈反向冲洗色谱柱60min。
　　2. 使用过缓冲盐：分析完成后，先用上述方法除去缓冲盐，然后再用纯甲醇或乙腈反向冲洗色谱柱60min。
　　3. 补救方法：
　　水 —— 乙腈 —— 氯仿(或异丙醇)—— 乙腈 —— 水
　　每一步以1.0ml/min流速反向冲洗色谱柱60min。

1．使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）
2．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围
3．避免流动相组成及极性的剧烈变化
4．流动相使用前必须经脱气和过滤处理
5．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存于甲醇或乙腈中
6．氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。

日常维护注意事项：

（1）流动相的ph值应有使用范围内：由于流动相的ph 控制不当而对色谱柱造成的损害，通常很难是色谱柱恢复，因此必须认真对待，严格控制流动相的ph值。

（2）去除样品和流动相中的固体颗粒：样品和流动相中含有的固体颗粒物质会堵塞色谱柱筛板，筛板被堵住不仅会引起柱压的升高，而且也会引起柱效下降，因为筛板的堵塞会引起液流不均，导致色谱峰型拖尾、变宽，从而使柱效下降。因此，建议使用超纯水和色谱纯试剂，在分析样品前对样品进行针筒过滤，流动相过0.45μm滤膜。

（3）使用保护柱或在线过滤器：样品和流动相经过滤后并不能完全消除固体颗粒物质，因为泵的磨损、密封圈和管路的老化也会产生固体颗粒物质，这些固体颗粒被流动相带入色谱柱，堵塞筛板，导致柱压升高、柱效下降。保护柱和在线过滤器上都有筛板，其孔径与色谱柱孔径相同，因此可以阻止固体颗粒物质到达色谱柱，有效防止色谱柱筛板的堵塞。由于柱压升高在分析故障中占很大比例，因此，除对样品和流动相进行过滤外，建议您在色谱柱进样端加上保护柱或在线过滤器。

（4）正确使用缓冲盐：缓冲盐通常易溶于水，难溶于有机溶剂，因此缓冲盐使用不当会使其析出，堵塞填料基质上的微孔和颗粒间的空隙，使填料板结，柱压上升；同时阻碍了基质上键合的碳链自由舒展，使色谱柱的保留能力下降，柱效降低。缓冲盐析出后，去除非常困难，因此，正确的使用缓冲盐对延长色谱柱使用寿命非常重要。正确使用缓冲盐的方法可归结为一句话：使用前要过滤，使用后要冲洗。

（5）防止强保留物质在色谱柱上存留：强保留物质和大分子化合物在色谱柱中累积，对样品中的化合物产生额外的保留行为，不仅引起峰型变宽、拖尾，使柱效下降，同时也会引起保留时间的变化，累积到一定程度时还会导致柱压升高。由于强保留物质和大分子化合物对色谱分离的影响是一个累积效应，需要一定的时间才会体现出来，但对许多药品特别是复杂样品而言，很难判断其是否是含有强保留物质。

C18色谱柱是由柱管、螺丝、接头等其他部分组成的，为了延长使用寿命，不仅仅除了与所分析的样品和流动方面有关系之外，还与其他的几个注意事项有关。
　　C18色谱柱的系统注意事项:
　　1、更换C18色谱柱之前，必须要对使用的色谱柱进行冲洗、平衡后，保存在有机溶剂中(最好是乙腈中)。
　　2、开、关系统，流速应有缓冲(1ml→0.8ml/min→0.4ml/min→0ml/min)，以免压力突变致使柱头填料塌陷。
　　3、取下C18色谱柱的时候，应该立即将两端封口。
　　4、流动像是缓冲液系统，不要直接切换到强溶剂，突然转换到高浓度有机溶剂可能会使HPLC流动体系中的缓冲液沉淀，这样会导致更大的问题如柱头堵塞、管道堵塞、泵泄露、活塞损伤或进样法转抽失灵，应该先用无缓冲流动相(即把缓冲液换成水)，冲洗5~10个柱体积以后才更换强溶剂。
　　5、除特殊情况外，一般都应使用预保护柱。
　　6、做完测试之后，切忌直接用100%有机溶剂冲洗柱子，须用90%水-10%有机溶剂(如流动相是缓冲液，应用纯水或含5%有机溶剂-水溶剂)冲洗至少30min后，用有机溶剂冲洗30min左右，最后将C18色谱柱保存在有机溶剂中。