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液氮冷冻保藏

省部重点实验室

2012/04/24

生命科学仪器综合讨论

问:菌种用20%甘油保藏，由于当时没有找到-80度冰箱，先在-20度冰箱保藏，但是转到-80度冰箱时，发现管内液体不是呈现固体冰的现象。是甘油与水没完全混匀的缘故吗?如果甘油浓度过高会有影响吗？

答:液氮保存是菌悬液和甘油1:1配比的(甘油50%),20%没有问题.

液氮冷冻保藏法　　

（1）准备安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1．2mm液体的。　　

（2）加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞，1．05kg/cm2，121．3℃灭菌15分钟：若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10％的甘油蒸馏水溶液或10％二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌15分钟。　　

（3）接入菌种将菌种用10％的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。　　

（4）冻结再将已封口的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。　　

（5）保藏经冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器（图Ⅶ-14）的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃，液态氮内为-196℃。　　

（6）恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入38—40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。　　

此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。

关键词:菌种保藏液氮冷冻保藏法

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