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再谈如何增加PCR 的保真性

  • 省部重点实验室
    2012/05/05
  • 私聊

PCR

  • 高温DNA POLYMERASE是以单链DNA或RNA为模板,在dNTP和一些阳离子的存在情况下,在特 定的引物指导下按3'-5'方向合成DNA.包括3种类型

    a.5'-3'方向的DNA合成能力,没有3'-5'方向的外切酶特性.如Taq及其突变体.这类酶的合成 i

    能力强,因为他不纠正合成中出现的突变


    b.与a类似,有合成活性,没有3-5的外切活性.但他们能以RNA为模板,合成DNA. 如Tth DNA <Ml,
    Polymerase


    c.有DNA聚合活性,没有逆转录活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfu DNA Polymerase.可
    以提高忠实性。但是这些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。
    将Taq DNA聚合酶同带有3'到5'外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独T
    aq DNA聚合酶高的忠实性,并可以得到高产量及扩增长模板。
    除了酶,高浓度的dNTP或镁离子会降低忠实性。将dNTP的浓度从200μM降低到25-50μM可

    以增加精确度如果四种核苷的浓度不同,忠实性会受影响。进行较少的PCR循环也会有助于
    增加忠实性,因为增加循环数目和产物长度就会增加突变可能性。
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