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ABI 7000型定量PCR仪中文操作手册

  • hrb_vip_ly
    2005/02/22
  • 私聊

PCR

  • 本想在附件中发上来但总是要让我去等验证,只好这样发了美国应用生物系统公司
    ABI Prism® 7000型荧光定量PCR仪
    操作手册
    快速入门指南
    美国应用生物系统中国公司· 技术服务部2003年
    ABI Prism 7000中文操作手册
    目录
    一. 开机............................................3
    二. 实时定量的软件运行..............................3
    1. 新建文件.....................................3
    2. 探针设置.....................................4
    3. 填样品表.....................................4
    4. 参比荧光.....................................5
    5. 循环参数.....................................5
    6. 启动扩增6
    1. 数据分析.....................................6
    2. 基线设定......................................6
    3. 线性图谱......................................6
    4. 原始数据......................................7
    5. 标准曲线.......................................7
    6. 实验报告.......................................7
    四. 终点读板的软件运行.............................7
    1. 新建文件.......................................8
    2. 探针(DETECTOR)设置..............................8
    3. 位点(MARKER)设置................................8
    4. 填样品表........................................8
    5. 参比荧光.......................................8
    6. 终点读。。。。。。。。。。9
    五. 终点读板的数据分析...............................9
    1. 数据分析...........................................9
    2. 信号分布...........................................9
    3. 基因分型...........................................9
    4. 保存结果...........................................9
    六. 日常维护..........................................10
    1. 荧光污染的检查与处理...............................10
    2. 检测器光源的更换流程...............................10
    2
    ABI Prism 7000中文操作手册
    ABI Prism 7000型荧光定量PCR仪
    快速入门指南
    一. 开机
    1. 确认电脑与主机的数据通讯线(灰色USB连线)连接正确。
    2. 确认电脑处于外接电源供电状态。
    3. 启动电脑,以Administrator用户名登录,进入Windows2000操作系统。
    4. 待桌面图标出现后,打开7000主机的电源。
    5. 待主机的电源指示灯点亮后,启动7000 SDS应用软件。
    在进行实验之前,请先检查样品加热模块以确定它没有受到荧光污染,具体方法请按照第6节的“荧光污染的检查与处理”流程进行。
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  • 第1楼2005/02/22

    本想通过附件来发,但总是要让我通过验证,没办法办好这样发了 二. 实时定量的软件运行
    基因表达的绝对定量和相对定量研究、转基因食品的检测(GMO)、各种病原体的检验检疫等各种定量应用;以CT值的大小作为样品阴性、阳性判定依据的定性应用;以及SNP检测、等位基因鉴定实验等的第一步PCR扩增,都是采用实时定量模式,按照以下步骤操作。
    1. 新建文件菜单File → New,Assay选择Absolute Quantification (实时定量模式),打开一个空白的96孔板文件。
    3
    ABI Prism 7000中文操作手册2. 探针设置双击任意一个孔,打开Well Inspector窗口。该窗口也可以从菜单View → Well Inspector打开。
    3. 首次使用软件,或者探针(Detector)没有设置好,请点击Add Detector按钮,打开Detector Manager窗口。该窗口也可以从菜单Tools → Detector Manager打开。如果Detector列表中没有合适的探针,点击按钮File → New,新建探针:设定探针的名称(建议使用所研究基因符号加标记荧光,如GAPDH_FAM、ACTIN_VIC等)、报告基团(FAM或者VIC)、淬灭基团(TaqMan探针选TAMRA;MGB探针选None)、颜色(任意指定)等。设置完成后点击OK,该探针即出现在探针列表中。重复此过程,设立其他的探针。
    4. 在Detector Manager窗口,从探针列表中点击选择所需探针,按住Ctrl键可以选择多个探针,再点击Add to Plate Document按钮。最后点击Done关闭Detector Manager窗口。此时Well Inspector窗口仍然是打开的。
    5. 填样品表在96孔表中选定有样品的一个或多个孔,在Well Inspector页面的Sample Name栏中填入样品名称;在探针列表的Use项下的方框中,打钩选择要用的一个或多个探针;在Task栏中选择指定样品类领:阴性对照选NTC;未知样品选Unknown;标准品选Standard。对于Standard,还要在Quantity栏中输入DNA拷贝数。注意:只有在这里输入拷贝数后,软件才能自动生成标准曲线。建议标准品的浓度在5点以上。建议每个样品(包括标准品)都按照统计学要求作一定数量的复管。
    4
    ABI Prism 7000中文操作手册6. 参比荧光如果使用的是ABI公司的定量PCR试剂,如TaqMan Universal PCR Master Mix或者SYBR Green PCR Master Mix等,参比荧光(Passive Reference)选ROX;如果使用的试剂中不含有参比荧光,请选None。完成后点击右上角的X按钮,关闭Well Inspector窗口。
    7. 循环参数切换到Instrument页面,设定及修改PCR热循环程序:在ABI公司默认的程序中,50°C 2 min是UNG酶起作用的步骤,UNG酶可以预防PCR产物(其中以U代替T)对定量PCR的污染;95°C 10 min的作用是激活金牌Taq酶,同时灭活UNG酶;40个循环的95°C 15 sec和60°C 1 min是定量PCR的循环步骤。7000默认在最后一步,也就是60°C 1 min复性和延伸时收集荧光信号。如果使用ABI公司的定量PCR试剂,上述参数不需要调整,直接运行PCR循环就可以了。在使用其他厂家试剂的情况下,如果其中没有UNG酶,请删除50°C 2 min步骤;如果使用的不是金牌Taq酶而是其他普通的Taq酶,请删除95°C 10 min步骤。
    8. 循环参数的修改方法删除:按住Shift键并在相应的Stage或Step中点击,使该步骤被选中变黑,再按Del键即可删除。插入:在需要插入参数的位置点击,出现粗黑竖线后,分别点击Add Hold、Add Cycle或Add Step按钮添加保温、循环或循环中的一个步骤。修改温度和时间:拖动鼠标,选中需要修改的温度或时间数字,输入新的数值即可。
    9. 其他设置反应体积:定量PCR的标准反应体积是50 µL;如果想修改的话,建议大于25 µL。融解曲线试验:在Dissociation Protocol选项左边的方框中打钩,仪器即在定量PCR循环完成后继续做融解曲线试验。如果是采用SYBR Green I染料方法进行定量研究,建议进行融解曲线试验,以判定PCR反应特异与否。单峰表示单一的PCR扩增产物,多峰表示PCR扩增有杂带。注意:只有SYBR Green I染料方法才需要进行融解曲线试验,TaqMan探针和MGB探针法都不需要。9600 Emulation:选中此项,即可使7000的升降温速度减慢,与9600和7700一样,从而可以直接使用在9600、7700型PCR仪上优化好的循环条件,而不需任何修改。
    10. 启动扩增点Save按钮保存文件设置。确认96孔板或全部样品管在主机内放置妥当后,点击Start按钮,开始PCR循环。屏幕上动态显示PCR进程和剩余时间。
    5
    ABI Prism 7000中文操作手册11. 监控进程切换到Results页面的Amp Plot子页面,可以实时显示PCR曲线随着循环增加而逐步增长的实际情况。如果Detector选FAM或VIC,只显示对应探针的变化情况;如果选All,则同时显示所有探针的反应进程。
    12. 保存结果程序结束后,点Disconnect按钮,然后File → Save保存实验结果。可以保存为.sds格式,也可以保存为.sdt格式,作为以后同类实验的模板,节省软件设置时间。

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  • 第2楼2005/02/22

    三. 实时定量的数据分析
    1. 数据分析切换到Result页面,进入扩增曲线(Amplification Plot)子页面,查看软件已经自动分析好的实验结果。注意:此时的数据是软件根据默认值(基线起点为3,终点为15)得到的初步结果,还需要根据本次实验的具体情况,精细调节Baseline(基线)的起止点后,重新分析,以得到更精确的数据。
    2. 基线的起点和终点确定原则基线(Baseline)是指PCR开始时信号很低、接近背景且比较平稳的那个阶段。起点要避开开始几个循环由于高温导致的信号增高,设在信号已经降到背景高度且能维持平稳的地方,一般在3到6个循环之间;终点要避免覆盖信号已经开始有明显增长的地方,一般在本组数据中最小的CT值前再3个循环处。另外,起点与终点之间最好能间隔8个循环以上,以满足统计基线标准偏差的数学要求。调整好起止点以后,再点击Analyze按钮,软件即自动计算新的阈值和CT值,并更新实验报告。注意:此时扩增曲线页面上显示的阈值数字并不更新,但是这不影响后台数据运算的准确。
    3. 线性图谱在默认的设置中,PCR扩增曲线图谱的纵坐标代表经过ROX和空白校正后的相对荧光信号强度,横坐标代表PCR循环次数(从1到40);纵坐标以对数表示,横坐标以线性表示。如果要看完全线性的S形图谱,请双击纵坐标轴线,打开坐标设置窗口,将纵坐标改成线性形式。
    6
    ABI Prism 7000中文操作手册4. 原始数据切换到Component子页面,察看原始数据。正常的FAM信号强度,基线时约为5000点,扩增完成达到约28000点,中间呈S形增长;TAMRA和ROX的信号开始时都比FAM的基线要稍低一点,TAMRA信号到指数增长阶段会降低,而ROX信号是水平稳定的,不随PCR进程而改变,因为ROX是以固定浓度加入到PCR试剂中的,它本身并不参与PCR扩增。
    5. 原始数据切换到Spectra子页面,也可以察看原始数据。Spectra与Component这两个页面的区别是:Component显示的是信号强度随时间(即PCR循环次数)的变化,是纵向的;而Spectra显示的是每个PCR循环点上信号强度在不同波长上的分布,也就是在4个滤色片上的分布,是横向的。
    6. 标准曲线切换到Standard Curve子页面,察看标准曲线。注意:只有在Set up时输入标准品的拷贝数后,软件才能自动生成标准曲线。
    7. 实验报告切换到Report子页面,察看实验报告。确认无误后,保存结果。也可以从File菜单中选择Export,再选择数据类型,输出各种类型的数据,包括CT值、相对信号强度、原始数据、融解曲线数据和实验结果等。输出的数据可以用Excel打开,并可在Excel中重新生成扩增曲线、标准曲线等图谱。
    四. 终点读板的软件运行
    各种等位基因鉴定实验,包括SNP检测、基因突变检测等,都包括两个阶段:1、PCR扩增;2、扩增后的荧光信号读取(Post-read)和数据处理。第一步既可以在9700、9600等普通的PCR仪上进行,也可以在7000、7900等定量PCR仪上进行;第二步
    7
    ABI Prism 7000中文操作手册必须在定量PCR仪上进行。以下只叙述第二步Post-Read和数据处理的操作方法。如果第一步也在定量PCR仪上进行,请按第三节实时定量的实验方法设置和运行软件;待PCR完成、数据保存好后,再将同一块板放在7000上,按以下步骤操作。
    1. 新建文件菜单File → New,Assay选择Allelic Discrimination (终点读板模式,用于SNP分析等),新建一个空白96孔板文件。
    2. 探针设置双击任意一个孔,打开Well Inspector窗口。该窗口也可以从菜单View → Well Inspector打开。
    3. 首次使用软件,或者Marker没有设置好,先点击Add Detector按钮,打开Detector Manager窗口。该窗口也可以从菜单Tools → Detector Manager打开。如果Detector列表中没有合适的探针,File → New,新建探针,设定探针的名称(建议使用等位基因的名称加标记荧光,如Allele 1_FAM、Allele 2_VIC等)、报告基团(FAM或者VIC)、淬灭基团(TaqMan探针选TAMRA;MGB探针选None)、颜色(任意指定)等。设置完成后点击OK,该探针即出现在探针列表中。
    4. 位点设置Detector设置好后,点击Add Marker按钮,打开Marker Manager窗口。该窗口也可以从菜单Tools → Marker Manager打开。如果在Marker列表中找不到合适的探针,点Create Marker,取名(建议使用位点的名称,如D2S1356等),OK,新位点的名字即出现在左边的位点列表中,选中位点,在右边的探针列表中打钩选择与该位点配套的探针,一般FAM、VIC各一个组成一套。
    5. 选择位点Marker设置完成后,在左边的位点列表中选中该Marker,点击Copy to Plate Document按钮,该Marker的信息即分成3行出现在Well Inspector窗口中。重复选好全部所需Marker,再点击Done关闭Marker Manager窗口。注意:定量PCR实验只要求设置探针(Detector)即可,而SNP实验既要设置探针(Detector),还要设置位点(Marker)。如果没有设置Marker,软件将不能进行基因分型。
    6. 填样品表在96孔表中选定有同类样品的一个或多个孔,在Well Inspector页面的Marker列表的Use项下的方框中打钩,选择要用的Marker,然后在探针的Task栏选择指定样品类型:阴性对照选NTC;未知样品选Unknown。没有Std。
    7. 参比荧光如果用的是ABI公司的PCR试剂,如TaqMan Universal PCR Master Mix with or without UNG,参比荧光(Passive Reference)选ROX;如果所用试剂中不含ROX参比荧光,请选None。
    点击右上角的X按钮关闭Well Inspector窗口。
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    ABI Prism 7000中文操作手册8. 循环参数切换到Instrument页面。PCR热循环程序只有60°C一个步骤,不需要修改。设置反应体积。SNP的标准反应体积是50 µL。点Save按钮保存文件设置。
    9. 终点读板确认96孔板或全部样品管在主机内放置妥当后,点击Post-read按钮,开始读取数据,大约10秒完成。
    10. 保存结果程序结束后点Disconnect按钮,然后File → Save保存实验结果。
    五. 终点读板的数据分析
    1. 数据分析切换到Results页面,Allelic discrimination子页面,在Marker下拉菜单中选择要查看其数据的Marker,在下面96孔板界面中按Excel方式选择需要查看的样品孔,软件即在中间的图谱上显示信号的分布情况。选择不同的Marker,显示不同的信号。可以点击放大或缩小工具调整图谱的大小。
    2. 信号分布正常的信号应该分为4组,靠近原点处为NTC;靠近X轴的是VIC信号,是纯合子,其正常信号强度范围在2-8之间;靠近Y轴的是FAM信号,是另一种纯合子,其正常信号强度范围在4-16之间;靠近对角线位置的样品中既有FAM信号也有VIC信号,是杂合子,强度为FAM和VIC各自的一半左右。
    3. 基因分型点击套索工具,然后通过鼠标圈定NTC信号,在Call下拉菜单中选NTC,这些数据点即被分型为NTC并显示相应的颜色和图标;同样分型FAM纯合子、VIC纯合子和杂合子。
    4. 保存结果切换到Report页面看实验报告。确认无误后,保存分析结果。也可以从File菜单中选择Export,再选择数据类型,输出各种类型的数据。
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    ABI Prism 7000中文操作手册六. 日常维护
    1. 荧光污染的检查与处理新建一个空的96孔板,菜单Instrument → Calibrate打开ROI Inspector窗口,将Exposure Time调到4096,选定Filter B,点击Snapshot按钮(不要动下面两个按钮,以免ROI设置出错),此时可以看到排列整齐的96孔图像。如果观察到特别明亮的光斑,则表明该孔存在荧光污染。将光标移动到单个孔的上方可在右侧栏中的Pixel Intensity处读出该孔的荧光信号值,超过500以上的需要清洗。清洗时尽量使用较细且无硬物突出的干棉签擦拭;如果未能去除,可用去离子水清洗;如污垢顽固,可使用90%乙醇清洗,但要等乙醇完全挥发干净后方可盖上热盖,以免有机溶剂损伤热盖上的透镜组。
    2. 检测器光源的更换流程关机冷却约15分钟后,打开仪器顶部盖板,拧松灯泡保护罩的螺钉,取下保护罩,将灯泡拆下,更换新的灯泡并插好连线。注意:备用的新灯泡必须保存在干燥环境中。
    (Last revised: 2003-10-20)
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  • 第3楼2005/02/22

    为了便于大家下载,我在附件里再放一个完整的,等验证过后,有需要的朋友去那里下载。
    相关附件

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  • 第4楼2007/11/30

    这么好的资料怎么没人回应啊?

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  • 第5楼2008/04/02

    虽然是7000的资料,还是值得一读!

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