省部重点实验室
第1楼2012/05/05
策略
利用PCR扩增基因组或者克隆的DNA样品,两条寡核苷酸链与DNA的两侧相结合。 其中一条链的5'末端附加40-45nt的GC富含序列;该5'末端结构在PCR过程中掺入扩增 的DNA片端的5'末端。扩增的DNA片段在对待测DNA浓度合适的变性剂梯度胶中电泳, 凝胶用EB染色、紫外检测。因突变或中性多态性而具有一个碱基差别的DNA片段在凝 胶中迁移到不同的位置,经EB着色呈现不同的带。
在开始使用PCR/GC发夹方法前有几个方面需予以考虑。如下面将要讨论的,尽管 可用DGGE检测和1000bp的DNA片段,但该方法检测500bp和更短的DNA片段更为有效。 在PCR扩增以及DGGE过程中,可用几种不同的方法来选择寡核苷酸以达到最佳实验结 果。此外,有三种不同的方法来决定对于每个扩增DNA片段最佳的变性梯度以及电泳 时间。 @
寡核苷酸的设计
在使用PCR/GC发地,必须选择用来扩增靶DNA的两个寡核苷酸。一般扩增最好是 选择长度在100-500bp之间的DNA片段。之所以选择范围的DNA片段因为用DGGE检测长 于500bpDNA片段时,突变型和野生型分子之间的分辨率会下降;此外,超过几百个碱 基对的DNA片段在聚丙烯酰胺凝胶电泳中移动非常缓慢,走电泳的时间太长,因此用 PCR/GC发夹的方法来检测几个kb的全基因,我们建议设计几对寡核苷酸将此基因扩增 成几个带有重叠的DNA片段。虽然用PCR可同时扩增多个片段,但扩增临近片段时应小 心避免产生不必要的复合体产物。因此,为了达到最理想的结果,每一对引物应分别 用于不同的PCR反应。但是通常可根据DNA片段的解链特性在DGGE之前、PCR扩增之后 将两个或多个片段混合,只用单孔胶分析多个片段。
根据DNA片段的核苷酸序列[6,7,14,15],有可能推知它的解链特性;并且根据 推论选择寡核苷酸的位置以便合成适合于DGGE的DNA片段。当然,也可以简便、有效 地选择靶片段而不用推知解链特性,选择扩增DNA片段的寡核苷酸并且在PCR扩增后选 择最佳的DGGE分析条件。下面将提供有关使用上述简便方法的具体建议:
省部重点实验室
第2楼2012/05/05
1、选择两个相对长度为20-25nt的核苷酸序列作为特异的引物通过PCR合成靶片 段。理想的引物核苷酸序列应该最少有50%G+C,并且不应该有间接重复序列。
2、设计两个PCR引物,其中一个有额外的40个100%G+C核苷酸附加在5'末端作为GC 发夹。解链推测以及我们的经验表明任何随机的GC序列都能达实验目的。当然有几个 建议可以避免一些问题。避免在GC发夹序列中的重复延伸,此重复结构在PCR过程中 形成干扰引物与模板退火的二级结构。同时在设计的GC发夹引物中,最好C碱基经G碱 基要多,并且使引物中的连续的G碱基减至最低。之所以如此,是因为寡核苷酸合成 仪合成含有少数相邻G碱基的引物产量很低。之所以如此,是因为寡核苷酸合成仪合 成含有少数相邻G碱基的引物产量很低。只要每个PCR反应分别进行,在每组引物中利 用相同的GC发夹序列都能得到满意的结果。我们曾用6个不同的GC发夹序列成功地扩 增出了几个不同的DNA片段。其中一个序列如下所示:
5'CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCC 3' h\3-8 m
该序列在3'末端接上长20-25核苷酸特异序列,此序列可与基因组DNA中的靶片段 区退火。虽然我们在该GC发夹中间加入了一个T碱基,因其会使Tm值降低,所以建议 不要采用此形式;我们建议使用含100%G+C的发夹,发夹顺序如上所示或类似。根据序 列的解链计算以及我们使用6种不同的GC发夹的经验,表明一个长40核苷酸的发夹最 为有效。因此超过该长度的发夹就没有必要。虽然短于40核苷酸的GC发夹与一些DNA 片段结合也有效,但它们对其他一些片段就不那么有效;因此,我们不主张使用少于 40个核苷酸的GC发夹。
3、对于大多数DNA片段,只需在其中一个的末端具有单一的GC发夹。有关的解链 预测以及某些实验表明GC发夹附着于DNA片段的两个末端并增加在DGGE上识别碱基的 分辩率。虽然我们还未扩增用两个分别含不同的GC顺序的寡核苷酸来扩增长达1000bp 的DNA片段,但仍有可能办到,然后用限制性内切酶消化扩增的DNA片段使其酶切位点 差不多位于DNA片段的中间位置,产生两个含GC发夹的片段。使用该方法可能存在的 问题在于两个GC引物在PCR过程中可能彼此干扰。
4、我们用变性的聚丙烯栈腕凝胶电泳纯化用于PCR的寡核苷酸引物;然而有些纯化 对于特异制备的引物可能是不必要的。因为含有GC-发夹的引物至少长60个核苷酸(40 个核苷酸的GC发夹与长20个核酸的特邓列结合),制备物通常含有干扰PCR结果的较短 寡核苷酸;这些片段很容易经制备电泳而除去。纯化之后,引物要经过酚抽提乙醇沉 淀及TE缓冲液悬浮(10mMTris.HCl.pH8.0,1mMEDTA,),使其终浓度达10pmol/μl