几种抑菌材料对化妆品中腐败菌的抑制作用比较

1 　实验部分
1.1 　材料
防腐剂: 壳聚糖(分子质量1.26 ×106 , 脱乙酰度为91 %) , 购自青岛百成海洋生物资源开发公司;壳寡糖(分子质量3 000) 、Germallplus、茶树油、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯等, 均由北京化工大学化大化新科技股份有限公司提供。
菌株: 大肠杆菌(代表革兰氏阴性菌) 、金黄色葡萄球菌(代表革兰氏阳性菌) 、黑曲霉(代表霉菌) 、白色念珠菌(代表酵母菌) , 均由北京化工大学微生物实验室张淑荣老师提供。
培养基: 牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌) : 牛肉膏0.3 g , 蛋白胨1 g , NaCl 0.5 g , 琼脂1.5 g ～2.0 g , 蒸馏水100 mL , pH 7.0 ～7.2 ; 察氏培养基( 培养霉菌) : NaNO3 0.2 g , K2HPO4 0.1 g , KCl0.05 g , MgSO4 0.05 g , FeSO4 0.001 g , 蔗糖3 g , 琼脂1.5 g～2.0 g , 蒸馏水100 mL , pH 自然; 沙堡氏琼脂培养基(培养酵母菌) : 蛋白胨1 g , 葡萄糖4 g , 琼脂1.8 g , 蒸馏水100 mL , pH 5.6。
1.2 　方法
1.2.1 　菌体的斜面培养和菌悬液的制备
细菌于牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基上活化(37 ℃下培养24 h) ; 酵母菌于沙堡氏斜面培养基上活化(28 ℃下培养24 h) ; 霉菌于察氏斜面培养基上活化(28 ℃培养7 d) 。活化后的菌种用生理盐水稀释成一定浓度的菌悬液。
1.2.2 　最小抑制浓度(MIC) 的测定
方法见文献。按稀释分离平板菌落计数法进行计数, 并计算抑菌率:
抑菌率= (对照实验菌落数- 相应试样浓度的菌落数)/对照实验菌落数×100 %
可以根据抑菌率为100 %时的防腐剂的浓度, 推出防腐剂的最低抑菌浓度(MIC) 。
1.2.3 　抑菌活性试验方法
添加一定量(5 mL) 的至其最低抑菌浓度的防腐剂溶液到90 mL培养基/ 250 mL (体积) 摇瓶中, 并加入5 mL 菌悬液,将摇瓶置于恒温摇床(细菌: 36 ℃±1 ℃, 真菌: 28 ℃±1 ℃) 中以180 r/ min 振荡, 每隔一定时间取样5 mL , 与不加防腐剂及加入HAc 溶液的菌液作对照。以去离子水为空白样作参比, 用紫外分光光度计于650 nm 波长下测定培养液的浊度( OD) , 并以此表征防腐剂的抗菌活性。

2 　结果与讨论
2.1 　各种抑菌剂对细菌的抑菌效果
选用了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌, 分别接种在牛肉膏蛋白胨琼脂平板来测定各种防腐剂对细菌类防腐效果。
　各种抑制剂对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抑制作用, 且抑制作用随抑菌剂质量分数的增大而加强, 但抑制程度不同。壳聚糖和Germallplus 对细菌抑制作用最强, 在质量分数0.50 %下就可达100 %的抑制, 壳寡糖抑制作用次之, 而茶树油抑菌效果较差。
2.2 　各种抑菌剂对酵母菌的抑菌效果
选用白色念珠菌为指示菌, 接种在沙堡氏琼脂培养基上, 测定各种防腐剂分别对酵母菌的抑菌效果。
　几种抑制剂对白色念珠菌都有一定的抑制作用,且抑制作用随质量分数的增大而加强, 壳聚糖和Ger-mallplus 对白色念珠菌有很好的抑制作用, 在质量分数0.75 %的条件下就可以达到100 %的抑制; 但壳寡糖与茶树油的抑菌效果就较差。
2.3 　各种抑菌剂对霉菌的抑菌效果
选用黑曲霉为指示菌, 接种在察氏琼脂平板上来测定各种防腐剂对霉菌的防腐效果。
　黑曲霉对Germallplus 非常敏感, 在Germallplus 质量分数为0.1 %时就能达到100 %的抑制作用; 而壳聚糖对黑曲霉非但没有抑制作用, 甚至有助于其生长; 茶树油对黑曲霉的生长有一定的抑制作用。
2.4 　各种防腐剂的MIC 值比较
MIC 值越低, 相应试样的抗菌效力越强, 由上述表可以得出壳聚糖等防腐剂的MIC 值。
壳聚糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及白色念珠菌都有很强的抑制作用, 但低浓度的壳聚糖对黑曲霉菌非但没有抑制作用, 甚至有助于其生长。壳寡糖的分子质量比壳聚糖小, 抑菌效果降低。Germallplus 的抑菌效果与化妆品中常用的抑菌剂对羟基苯甲酸丙酯的抑制效果相当, 而茶树油的抑菌效果较差, 需要相当大的添加量才能达到较好的抑菌作用。
2.5 　几种抑制剂对菌生长曲线的影响
研究了几种抑制剂在其最低抑菌浓度时对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌的抑制活性。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌在含有不同抑制剂的培养基中培养72 h过程中, 培养基浊度的变化情况。从中可以知道, 在实验浓度下, 几种抑制剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的生长都有一定的抑制作用。其中, 抑菌效果以对羟基苯甲酸酯、壳聚糖及壳寡糖为佳, 接种后72 h内培养基中的菌生长均被抑制在一个较低水平,达到100 %的抑制。Germallplus 对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的抑制作用比对大肠杆菌的抑制作用强。可以分别使金黄色葡萄球菌、白色念珠菌延迟22 h、24 h进入对数生长期。而茶树油对大肠杆菌、白色念珠菌的抑制作用比对金黄色葡萄球菌的抑制作用强, 在其最低抑菌浓度下对白色念珠菌在50 h内可以达到100 %的抑制, 从第56 h起, 菌生长才出现一个增长期。