外源DNA片段末端性质 | 连接要求 | 连接结果 |
不对称粘性末端 | 两种限制酶消化后,需纯化载体以提高连接效率 | 载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留;非重组克隆的背景较低;外源DNA可以定向插入到载体中。 |
对称性粘性末端 | 线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理 | 载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留;重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝;外源DNA会以两个方向插入到载体中。 |
平端 | 要求高浓度的DNA和连接酶 | 载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失;重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝;非重组克隆的背景较高 。 |
省部重点实验室
第1楼2012/06/10
五、重组子的筛选
根据载体的遗传特征筛选重组子,如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段,其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点(MCS),它并不破坏读框,但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能,这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此,宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性,但它们同时存在时,可形成具有酶学活性的蛋白质。这样,lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补,称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下,在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落,因而易于识别。然而,当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后,几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段,使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选,又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后,有重组质粒的细菌形成白色菌落。
六、注意事项
1.目的DNA片段制备、回收、纯化时,应避免外来DNA污染。
2. 不同厂家生产的T4 DNA连接酶反应条件稍有不同,但其产品说明书上均有最适反应条件,包括对不同末端性质DNA分子连接的T4 DNA连接酶的用量、作用温度、时间等。同时提供有连接酶缓冲液(10×、5×、2×),其中多已含有要求浓度的ATP,应避免高温放置和反复冻融使其分解。
2.连接产物的转化:细菌细胞经特殊试剂处理后在适当的条件下具有接收外源DNA的能力,因此可将上述连接产物通过热刺激或电脉冲转化感受态细胞,当细菌大量增殖的同时,导入的重组DNA也得到增殖。
3.制备感受态细胞所用离心管、培养瓶最好经酸碱处理或使用新的,15 lbf/in2高压灭菌20min。
5. 白色菌落中重组质粒内插入片段是否是目的片段需通过鉴定。