[转帖]关于HPLC的一些常见问题

4.液相色谱柱
整个液相分析过程中，液相色谱柱是分析好坏、成败的关键，其作用的重要性犹如人的心脏。除开液相色谱柱外，其它所有的组件都是服务于液相色谱柱的（泵提供恒流溶剂用于淋洗、进样器定量注入样品，检测器响应出被柱分离后的单独组分含量的信号，工作站处理检测器的信号给出样品混合物的定性、定量数据）。由此可见，HPLC系统中液相色谱柱是非常关键的。它的好坏直接影响样品的分析效果。对于这个核心的关键组件，要求它必须分离能力要强（便于将复杂混合物逐个分离清楚）、柱容量要大（便于提高进样量以利于痕量分析，使之能检测出更小的浓度含量的样品）、分析速度要快（能做到0.5Hr内完成分析全过程，提高分析效率）。
液相柱的尺寸规格主要有两种，一种内径为4.6mm、另一种常见内径为2.0mm。柱子的长度由分析情况决定，但由于受柱前压（泵压≤40MPa）的限制，一般为10-25cm。由于液相柱需要有非常高的柱效（N≥40000），因此对于柱内表面光洁度、柱内死体积都要求很高。柱内表面一般需要抛光，其光洁度应在8级以上，并且要绝对避免轴向沟槽出现，以免样品产生轴流扩散（即部分样品从柱头顺着轴向沟槽不经柱内的二相交互区的相互作用就直接流出了液相柱子，没有完成分离过程），严重降低柱分离效能。径向沟槽对分离影响不明显，但也应尽可能避免，保持光洁。
从液相色谱柱的结构图中可以看出，除了要求柱内表面光洁无沟槽外，它的柱头结构也是非常科学的。此结构设计最大程度地缩小了死体积，并使溶剂流组分径向分布均匀，并且保持层流。减小了样品组分的横向扩散以及涡流、湍流形成的流型紊乱造成样品组分扩散，从而很好地保证柱的优秀的分析效能。在柱头的放大结构示意图上，不锈钢烧结的筛板（板上的贯通微孔直径＜5um=0.005mm，就是保证实现溶剂流在柱内轴向层流（平流）流动的关键组件，另外它也能保护柱内的填充料（固定相），将大的颗粒物柱填充料外侧，保护柱不被堵塞，能正常分析。应该来讲，柱子的本身的结构很好地将柱头效应（因其结构所引起的分离效能的下降）的影响控制在最小程度，应拥有突出的柱效。但实际并不如此，柱效往往还受到柱外效应与柱内效应的严重影响，尤其是柱外效应尤为突出。柱外效应由柱前与柱后两部分死体积所引起：柱前部分是进样阀与柱头间的连接管路容积（死体积）内的溶剂造成样品组分被稀释扩散（进样时是点状或塞状中心进样）及其流型（因管路结构引起）偏离层流所带来的影响；柱后部分是柱出口与流过池间的连接管路容积以及流过池本身容积造成样品分离后单组分被稀释扩散（表征在半峰宽变宽）及其流型（因管路与流过池结构引起）偏离层流所带来的影响。因此要保持柱的高效性，除了柱本的身合理设计外，还应充分考虑柱外效应等其它因素所带来的影响。
液相色谱分析柱优越的分离能力，上述的柱设计以及柱外效应对它是非常重要的，但并非是最为关键的因素。高的液相柱柱效关键在于柱内填充物（固定相）所起的分离作用。关于液相柱的分类因所填充物的不同分为几类（主要有液固吸附、液液分配、离子交换、体积排阻等），对各类柱的分离机理现简介如下：
a） 液固吸附色谱柱： 利用柱内所填的吸附颗粒对样品组分的吸附（主要是样品组分分子与吸附物分子间的静电力、氢键力、诱导力），在流动相的冲洗作用下又被脱附下来（主要是样品组分分子与流动相分子间的静电力、氢键力、诱导力）。依据各组分的脱附、吸附能力的差异得到分离。
b） 液液分配色谱柱： 利用样品组分在两种液体间（流动相溶剂与涂在颗粒物表面的固定液---一般为高分子化合物）的溶解度（溶解能力大小的表征）的差异得到分离。
c） 离子交换色谱柱： 利用样品组分中的离子（样品溶在流动相溶剂中必须能解离成离子的）与柱内的离子交换树脂（分阴、阳交换树脂）上可解离的离子间的结合能力的差异完成分离过程，结合能力强的后被冲洗出柱，结合能力弱的将被首先冲洗出柱。离子交换树脂有寿命限制、需要再生处理。
d） 体积排阻色谱柱： 很明显就是利用样品组分分子的体积大小的差
异，使之分离。在这里，分子大的将被首先被冲洗出柱。因为柱内的多孔
（有贯通的（有利）和半封闭的（有弊））颗粒物的孔径太小（小于分子个体），对大分子没有任何阻挡就从颗粒间隙中流过了。但分子体积小一些的因为可能被冲洗进多孔颗粒物内部的孔道，然后再又被重新冲洗出来，因此在柱内的停留时间要更长些，比分子体积大的要晚出柱。
**当然，涉及完全的吸附分离或体积排阻都会多少发生一些不可逆吸附（结合得很牢固，脱附相当困难）、化学吸附（这类吸附完全脱离了物理吸附所依靠的物理作用力，而是由分子外层电子间形成新的键合作用力，从某种意义上讲是形成了新的化学物质）。它的发生降低了柱效，是我们所不希望的。
在液相色谱柱的繁杂的分离机理前,我们不作过多介绍,详细论述请参见相关的书籍。这里主要就HPLC系统中最为广泛使用的C18反相液-液分配色谱柱作一简单描述。
反相色谱：是指流动相溶剂的极性大于其固定相极性的一类分离模式。它应用广泛，主要因为自然界中大部分有机化合物都存在着非极性基团，这些基团可与固定相的非极性基团相作用，进行分离。如C18反相柱，固定相因球状硅胶颗粒表面所涂的十八烷而非极性；其常用流动相为水、甲醇、乙晴等强极性溶剂。使用这类柱的谓之反相色谱。
C18反相液-液分配色谱柱的固定相颗粒的示意图如下：

由上图，固定液（十八烷）均匀涂布在担体（球状硅胶颗粒）上，硅胶颗粒很细，其直径一般为5um，是液谱柱固定相常用的固定液承载体（即担体），这种均匀的涂覆并不是一般物理性覆盖在球体表面上。从它的化学结构可见，C18烷基基团与球体硅胶表面的化学基团（硅醇基团Si-OH）发生化学作用，形成非常稳定化学键合结构。这样结构称为化学键合结构，固定相称为化学键合固定相。键合固定相能很好地耐酸、耐碱、耐有机溶剂的冲洗，是液谱柱固定相中最为理想、也应用最为广泛的固定相。此种结构有如下优点：1、硅胶球体颗粒小而匀称，其表面没有坑点形成液坑，因此传质快（阻力小了），柱效能高。2、固定液是化学键合在表面的，非常稳定，不易流失，增加了柱的稳定性与寿命。其表面处理上固定液后，消除了活性中心，提高了柱效。3、由于可以在硅醇基团Si-OH上键合上其它不同极性的官能基团（C18中的十八烷基团属于非极性基团），能灵活地改变分离的选择性（键合上极性基团，适宜分离极性混合物；反之，键合上非极性基团，适宜分离非极性混合物）4、由于键合柱稳定性优秀，它有利于梯度洗脱。***极性越弱，；极性最强，越易溶于水，难溶于油。
在液相色谱柱上常用的固定液有：正十八烷（极性最弱）、聚酰胺、PEG-20M、β-β；---氧二丙晴（极性最强），不同的分析要求，可依据极性大小来选用所需的合适极性的固定液。在HPLC的分析中，液相色谱柱的选择可以参考以下几点：

1、 柱长度：以满足样品的分离为依据，通常是10-25cm，特殊情况下，为满足组分分离，在压力（泵出压力、材料耐压）允许的前提下，可以将几根柱串联使用，以增加柱效，完成分离。
2、 柱内径：通常为2.0或4.6mm，它依据所需柱容量的高低来取用。两类柱的柱效大抵相当。
3、 固定相：依据分析要求决定选用。如多孔型担体（硅胶、Al2O3、硅藻土等），化学键合固定相等。上述的C18全多孔硅胶颗粒就是应用广泛的化学键合固定相。依据键合固定液的不同，反相色谱常用的有，氰基柱＜苯基柱＜C8柱≌C18柱，其中C18柱极性最弱，因此对某个非极性组分比其它柱拥有更长的保留时间。
4、 流动相：依据固定相的不同以及样品的分离情况选用不同的流动相溶剂，包括溶剂组成种类、比例、流量。流动相所选的溶剂纯度要好、一般为色谱纯级；其用以改善分离效果（如减小峰型展宽等）的缓冲试剂也必须是分析纯级（AR）以上，高纯度的流动相能使HPLC获得优良的基线信号，并改善分离，提高样品分析的重现性。反相色谱常用的有：四氰呋喃、乙晴、甲醇、水等（按洗脱样品能力强弱排列），常见的流动相为它们的水溶液（首选，乙晴-水；其次，甲醇-水、乙晴-甲醇-水）。缓冲试剂主要有：H3PO4、磷酸二氢钠、邻苯二甲酸氢钾等盐类。缓冲试剂主要通过改变流动相的PH值（酸碱度）来改善分离，用量通常为0.1%，PH=2-7.5（硅胶类键合柱）。
**不同的反相流动相同一时间内完成某个样品组分的分离的能力近似如下：
C乙晴=0.322 CTHF+0.57 C甲醇
CTHF=0.66 C甲醇
（THF=四氰呋喃 CTHF表四氰呋喃的水溶液体积浓度）
各水溶液体积浓度的相当关系见下图：
例如图中红线，C乙晴（0.4）=0.322 CTHF（0.30）+0.57 C甲醇（0.50）=0.3816
液相色谱柱通常在常温下操作，当有特殊需要时，如需保持样品组分的活性、降低淋洗溶剂的粘度与提高样品的溶解度，从而达到充分分离与活性组分的保持的目的。装有柱温箱（水浴加热、电阻加热）的HPLC系统特别对于需要精确测量样品组分的保留体积（定性、定量）的分析显得尤为重要。柱温一般在：室温+10℃---

5.预柱（保护柱）
在实际的液相分析中，由于的复杂性，流动相洗脱能力等原因，都会不可避免地使液相分析柱所到损伤（如，柱被堵、固定相被严重污染），影响分析效果与柱的使用寿命。在众多的实际应用中，柱的损伤主要集中于柱进口端1-2cm的距离上。虽然可以去除这部分固定相，然后重新填充。但方法繁琐（液相填柱为匀浆高压填装，一般单位难以实现），且修复后的柱子整体柱效下降，分离能力变差，柱的各项分离参数也发生了变化。这一点将导致柱修复前后的分析结果失去可比性（即修复前后的数据是不关联的，定性、定量、重复性都失去了比较的基础）。而在分析柱前添加保护柱后，能避免上述缺陷，获得良好的分析结果。
保护柱是根很短的（2cm左右）柱芯，柱芯两端有烧结滤板，内部填装有与分析柱相同的固定相，整个柱芯装于一段空心柱管内，类似于分析柱的结构。当柱芯损伤时，柱芯是可以很方便地从空心柱管内取下予以更换的。其优点在于：
1、 柱芯更换方便，对整个色谱系统的分离参数影响很小。
2、 在某些情况下，随柱芯内填物的改变，可做预处理柱或反应柱（如柱前衍生、柱前预饱和处理）。
6.检测器
检测器HPLC系统中也是主要的核心部件之一，它将样品混合物从色谱柱上分离出来的各单独组分按比例地响应出来，从而完成分析工作的目的即定性与定量。从某种程度上讲，它的重要性并不亚于色谱柱，相当于人类的“眼睛”，所有的分离信息将从这儿获取。
检测器种类较多，但基本上它们的检测机理都是相同的：即依据样品组分的物理或化学特性的差异，将这些特性差异转变为能方便测取的电信号。电信号经处理后绘制成谱图，便于分析人员进行样品的定性、定量工作，并依据分析数据调整分析条件或指导相关的生产、研究工作。
目前市场上仪器化生产的液相检测器及其检测原理间例如下：
序号 检测器 原理 备注
1 紫外-可见光 利用样品对紫外光的吸收 应用广泛。局限：被测组分能吸收或被动吸收（经衍生化处理）紫外光。可梯度洗脱。灵敏度高
2 示差折射 利用样品对光的折射率差异 通用型，灵敏度低。
3 荧光 利用样品组分受光激发后会产生荧光的特性 局限：被测组分能产生或被动产生（经衍生化处理）紫外光。灵敏度非常高
4 电化学 利用组分的电性（如电导、电量）来计量 较为成功的是安培检测器，常用于离子色谱仪器。
5 蒸发光散射 利用样品颗粒对激光束的散射程度 通用型。类似于示差折光，但灵敏度非常高。可梯度洗脱。

上述简单枚举的5种液相检测器，是在实际应用过程中筛选出来的，能基本涵盖所有的液相分析的需求，各检测器各有优缺点与局限性。作为实际应用中，使用最为广泛的检测器-紫外---可见光检测器几乎是所有液相色谱仪器必备的检测器，
7.术语
A， 基线（Baseline）：指正常的操作条件下，仪器系统（热平衡、静电平衡、柱流出溶剂均一）后，柱上流出物经过检测器所产生的响应信号曲线。理论上稳定的基线是一条光滑平整的直线，该直线应与时间轴平行，如图中AP线。
B， 噪声（Noise）：在基线的局部放大部分，基线并不是一条理想的光滑平整的直线（即无组分流出时，响应信号不能恒定如一），而是随时间的变化在一个很小的范围内非常频繁地上下抖动的曲折线（即由于各种微平衡在被打破与达成平衡间反映出来的信号变化），这条曲折线称为噪声，记为Noise。噪声从根本上表征了整个分析系统的平衡情况与系统好坏。影响噪声大小主要有柱的好坏，溶剂的好坏，系统死体积大小，仪器电子元件部分的好坏，仪器部件（如流路结构、泵及检测池与光路的设计）的科学性，当然也包括信号的传送与处理。总之，它体现了系统的整体运行情况。噪声分短期噪声Nd（1-2min以内）与长期噪声Nc（10-20min以上）。一般来讲，Nd主要由分析系统本身的电路元气件部分的平衡造成的；Nc则是更多地反映了分析系统中柱平衡、溶剂变动（流量脉动、溶剂比例变化、溶剂流型异常）情况。
C， 漂移（Drift）：基线除了不光滑外，它也并不平行于时间轴，会随时间缓慢地发生偏离水平线的变化。一般以0.5-1.0小时内偏离起始点的幅度大小来加以度量，定为漂移，记作D。我们希望D小，并且是单方向漂移，这对于定量工作是非常重要的。漂移或上或下，说明系统偏离平衡，严重时需要及时排查原因，予以更正，否则将影响正常分析工作的开展。
D， 保留时间（Reserve）tR：它指样品组分在分离系统（主要是柱中）的滞留时间。时间的长短取决于组分在二相交互区间的分配平衡过程，与柱内固定相作用（易吸附于固定担体、溶解于固定液或形成离子对，总之容易“粘”在固定相上，就越难被重新洗脱下来）大的，其保留时间就会越大；反之越小。这一分配平衡主要由组分、固定相、流动相间的热力学性质控制。因此，在同一色谱条件下，任何一种组分都有其确定不变的保留时间，这是谱图得以定性的基础。当然组分有可能在特定条件下拥有相同的热力学参数，从而会有一样的保留时间。总之，同样组分必定有一样的保留时间；但保留时间相同的谱峰并不一定是同一组分。
**注，同一色谱条件指前后进样的分析条件（仪器、柱、流动相、仪器参数）不变，所不同的仅是重新注进的样品而已。
E， 死时间（Dead time）tO：即不参与分离分析的那部分体积，可以由不被柱内固定相作用的物质来测取。在HPLC中，死体积包括柱前（至进样阀）后（至流过池）连接管路体积，柱外体积、柱填料间隙体积、流过池体积等。死时间如图tO峰，通常表现为进样扰动峰（样品溶剂与流动相不同时尤为明显）。死体积的存在会使分离效果严重下降，因此必须尽量减小。理论上应在柱头进样，柱后即被检测，使剩下的体积即柱子成为唯一的、参与分析过程的有效体积。
F， 调整保留时间t`R：指保留时间中扣除不参与分析过程而浪费的那部分死时间tO后的有效时间，记为t`R。t`R是真正起分析效用的时间。t`R= tR -tO
G， 比保留时间/相对保留值r12：指某两个组分的调整保留时间的比值，r1 2=t`R 2 /t`R 1 比保留值是组分定性的重要参数，对于分析解读谱图更为有用。其优点在于只要固定相与柱温（热力学环境）不发生变化，流动相比例恒定，即使其他参数变化（柱长度、柱床情况、流速），它的比保留时间值也是始终一致的。r值也表征了分离的情况。
H， 峰底：指峰的起始与结束点间的连线如DF，峰的起始点与结束点的判定由工作站依据曲线上各点的切线（一次导数为0）与水平线间夹角θ的大小来判断。/Tgθ/＜X，峰的起点；/Tgθ/＞X，峰的落点。X称切线的斜率值，其值大小一般为默认值（如70），当然也可以依据分析人员的判断加以调整。
I， 峰底宽Y：即由峰两侧拐点JK（二次导数为0）处的切线交于基线的N、O两点间的距离即NO，拐点位于峰高的0.607倍的地方，拐点间距JK为曲线标准偏差值的2倍，NO=4σ。
J， 峰高h：峰顶点到基线的距离。
K， 半峰宽W1/2：位于峰高一半处的镫宽度如LM。其大小表征了物质传质的动力学因数。
L， 峰面积A：指由曲线GLJHKMIONG围成的面积。

1、 利用保留时间定性：即前述的利用色谱图上的保留时间来确定混合物的组分。在相同的色谱条件下，若混合物中谱峰保留时间与已知组分的保留时间一致时，则认为是同一种组分。
利用保留时间定性，简单、方便。但它的应用限制在了未知混合物必须是可以推定的，即按其来源或其他定性手段已限定在了某种化合物或某几种化合物中间，只有这样才能有目标地进行比对分析。
2、 利用比保留值定性：由于保留时间定性，色谱条件严格。自然界中的很多混合物的物理、化学性质非常相似，因此色谱条件的微小变动就会影响分离以及定性，必须减小色谱条件对定性的影响程度。由于比保留值r仅与柱温、柱固定相有关，而与其他不相关，对色谱条件的依赖性减小，提高了定性的可信度，但应用同样限制在了未知混合物必须是可以推定的范围。
3、 其它定性方法
a) 对照法：利用紫外检测器对样品进行双波长扫描/全波长停泵扫描/改变流动相组成等手段完成与标准品的比对。从而判定谱峰的纯度及其定性。
b) 叠加法：即将已知物加入未知物中，观察是否有谱峰被叠加、增高。若峰宽不变，峰高增加，则认为被增高的组分峰与已知物是同一物质。
c) 换柱定性：因为不同的组分很难在不同极性的柱上拥有相同热力学参数。因此将混合物与已知物分别在不同极性的柱上进行分离，若都有相同的保留时间，则认为他们是同一种物质。此法定性，可行度很高。
d) 联机定性：以上依据谱图的定性均受应用范围的限制在了未知混合物必须是可以推定的范围，但现实中往往是完全未知或不能推定的未知混合物，因此必须依靠其它专用的定性仪器进行联用。目前常用的有：质谱、傅立叶红外光谱与核磁共振等，具体请参阅相关书籍。
HPLC是分离能力强，但定性能力较弱的分析工具，因此特别对于未知物的定性更多地依赖于其它专业定性仪器。
从上述可见，色谱条件对于组分定性影响很大。在色谱条件内，对组分定性最为关键的是柱子的好坏。柱子费力效能差的，将不可能完成对混合物的分离，就更不可能进行定性工作。柱子的好坏有以下指标进行判定：
1、 分离度R：指相邻的谱峰保留时间值之差与其峰底宽度总和之半的比值。它表征了两组分在柱上的分离情况，反映组分分离过程中热力学、动力学的性质，是分离柱效与分离选择性的影响的总和，是柱分离能力的总指标（柱分离能力的总指标是有针对性的，对非极性分离能力很高的柱对极性物的分离并不一定好。即总指标是相对于组分而言的）。R值依据谱峰呈正态分布，当R＞1.0时，分离度达98%， R＞1.5时达99.7%，认为完全分离，是组分分离的标志。R值
*以R值来推定分析柱长：
若某个色谱条件下，组分A、B分离度为1.0即98%，如果完全分开则需要柱长度（原柱100mm）按下式计算：依据L=16×R2×（a/（a-1））2×H有效---其中a为柱对组分的选择性量度，H有效为有效塔板高度。对于同样的柱，其a、H有效在相同的色谱条件下是不变的。依此有：L1=（R12/R02）L0=（1.52/1.02）×100=225mm，依据计算完全分开需要将柱长增至225mm。
2、 柱效N：柱效的高低是柱子性能好坏的评价标志。柱效越高，其相互分配平衡的次数越多，分离能力越大（当然关键还是要有必要的容量因子）。柱效是有针对性的，同一根柱子对不同组分的柱效是不相同的。
有效塔板（每个塔板上完成一个平衡过程）数N有效消除了死体积的影响，能较为真实地反映柱效能的好坏。N有效越大，平衡次数越多，对分离越有利。但它不能作为判别混合物能否分离的依据，因为分离的关键在于组分与固定相的热力学因素的影响。N有效只能在某种条件下柱分离能力发挥程度的标志，即N有效与r值的大小相关联。
谱图定量及常用算法
从上述色谱定性来讲，HPLC是比较弱的。但HPLC能不预先分离混合物就能实现对组分的准确定量，这是它的最大优点，也是其它方法做不到的。
从检测机理上讲，色谱图的组分峰的大小（依据组分的物理特性）与组分的浓度大小是一一对应的，成线性关系。分析人员就依据峰面积来进行定量计算。但不同组分的浓度与峰大小的对应尺度并不一致的。
1、 谱峰面积的测量
依据峰呈正态分布（高斯分布），其面积为峰高与半峰宽乘积的1.065倍。
A=1.065×h×w1/2 （Au-s）
在现代HPLC中，峰面积都由数据处理机/工作站自动计算获得。
2、 定量校正因子f：
定量的基础是峰面积与浓度成线性关系，这对于同一组分来说不成问题。但不同组分在检测器上的响应能力是不相同的（见第二章检测器的波长扫描部分）。在HPLC中主要表现为相同浓度的不同组分对同一波长光束的光吸收能力不一样，如10-4的萘在254nm下可能响应出40000Au-s Au，但10-4的蒽在254nm下可能响应出15000Au-s。因此同样浓度的组分的峰面积就会不同，定量时就必须给各个组分不同系数（或折扣，也即数学上的加权），以获得一个统一的定量基准。对于上面的例子，若以萘为基准（其权值/系数f=1.0），则必须给蒽（f=40000Au-s /15000Au-s =2.667）2.667的系数/权值，这样才能获得1：1的结果。加权峰面积也能真实地反映组分浓度间比例关系，与标准浓度对照后，就能获得准确真实的浓度值（这一点由标准物的浓度/进样量/峰面积来确定这个对应关系。这种对应关系仅与色谱条件相关，不同组分的加权面积（即乘以系数被折扣后的面积）在同一色谱条件下是不变的。如10-4的萘/20ul进样量，其对应的峰面积为：40000Au-s，则10-4的蒽/20ul进样量的峰面积必定为：40000/2.667=15000 Au-s，若有菲组分，且其f值已测定为2.0时，若有峰面积10000，则其浓度必是：C=（萘10000×2.0/40000）×10-4）=0.5×10-4------计算方法如下：
绝对校正因子：f`i=Ci/Ai
对于HPLC---UV-Vis，其浓度与检测的信号成线性，是浓度校正因子。它为组分浓度与其对应的峰面积的比值。但实际上，f`i 主要是由检测器的灵敏度来决定的，同时受色谱条件的影响。它不易准确地被确定，也无法直接予以应用。因此在定量工作中，往往使用相对校正因子，即我们常称的校正因子，它定义为某物质与标准物质的绝对校正因子的比值。
由于在相同的色谱条件下，各个组分的响应信号所受到的外界影响幅度是完全一致的，因此校正因子是相对稳定的，不受操作条件与检测器灵敏度的影响。它很好地反映了组分真实浓度与分析结果的一致性。
3、定量的常用几种算法：
a)校正归一法
某个组分浓度的百分含量，为其加权面积与所有组分的加权面积的总和之比。
b)内标法
当样品分析过程中，由于样品处理、柱条件或流动相等色谱条件的限制，使有的组分不能出柱或出柱后在检测器上没有响应信号时，归一法就不能满足定量要求。但内标法能获得较好的结果。
内标法即是将某一个或几个标准物定量地加到已知量的混合物中，进样获取谱图。它不同于归一法，差别在于归一法的所有组分都能有响应，而内标法中只有部分组分有响应。因此必须人为加进标准物，给能有响应的组分一个比较的基础。加进的标准物必须能与原有组分分开并且其峰位位于组分峰间。
c)外标法（定量进样---标准曲线法）
外标法是指用待测样品中组分的纯物质（AR以上）配成不同浓度的量（或不同的百分含量），进样后获得进样量与谱峰面积的曲线图。分析时，只须定量进样（进样量必须与作标准曲线时的进样量一致），得到峰面积，再与标准曲线比较，获得样品浓度（或百分含量）信息。
外标法操作方便、简单、计算便捷。但准确性不高，完全依赖于进样量的一致性程度以及分析重现性的好坏。外标法的使用局限在其分析样的组成、其变动方向是已知的，多半用于工厂在线检测。
d)指数法（在不同的范围内建立一个非线性的校正曲线）
指数法一种色谱分析中常用的定量方法，它通过两个不同浓度的标准样品，建立指数校准曲线，来定量分析被测组分。
计算公式：　C% ={EXP(F1 lnhi+F2)/ Wspl}×100
其中 　F1 　某个峰的第一点浓度的校正因子
F2 　某个峰的第二点浓度的校正因子
Hi　 某个峰的高度
Wspl 样品的重量

其他术语：
1、灵敏度S，指检测器对一定量组分的响应信号的强弱，是检测器评价的重要指标。
S=电信号增量/进样增量=ΔR/ΔQ（Au/（g/ml））
SC=FA/m（F为流量、A为峰面积）
指每1ml流动相中所含的每mg/ml样品所产生的吸光度。
2、检测限D*，指恰能产生于2倍噪声的信号峰时所需要的最小进样浓度CMin，浓度过低，则其信号峰将被淹没于噪声里，不能被辨认出。
D=2N/S 一般D值越小，检测器越灵敏。
*注：依据国际纯粹化学化工联合会，也可取为3倍噪声。
3、最小检测量QMin，指恰能产生于2倍噪声的信号峰时所需要的最小进样量。
QMin=CMin×V （V为进样量体积，CMi为最小进样浓度）
4、线性范围P，指检测器输出信号的大小随样品量的增减而相应地同幅度增减。通常线性范围的下限为最小进样浓度CMin，其上限是在保证响应成线性(偏差不大于5%)的基础上的最大进样浓度CMax。线性范围即为其上下限的比值P=CMin/CMax，一般在104—105
5、响应时间τ（也称时间常数），指样品组分进入流过池（检测器）到输出其对应真实信号的63.2%时所需的时间，如能响应1.0Au（指流过池内瞬间的组分浓度能够产生的吸光度）的组分进入流过池时到检测器响应输出0.632Au信号时所花时间t，称为响应时间τ。它反映了检测器对组分变化的信号反应快慢，类似于混合器的滞后时间。τ值一般在0.5-1.0s就能满足通常谱峰的响应速度。当然，浓度变化大，谱峰尖锐（半峰宽很窄）的样品分析时，τ值应小些，至少不能大于半峰宽的10%（即τ＜10%W1/2＝，否则谱峰将失真变矮、胖，甚至漏峰。

8.仪器的日常维护
仪器在使用完毕后的维护非常重要，它直接影响色谱仪、色谱柱和进样阀的寿命。比较完全的维护如下：
1．如果流动相中含有缓冲液，在仪器使用完毕后，首先打开仪器的排放阀，用纯水3～5ml/min的流量冲洗高压输液泵，时间约10～15分钟，这是为了彻底冲洗干净残留在泵系统内的缓冲液盐分。
2．上述完毕后，关闭排放阀，用含5％的甲醇、水溶液1ml/min的流量冲洗整个色谱液体流路系统，时间约10～15分钟，这是为了冲洗干净残留在排放阀后的流路中的缓冲液盐分。
3．上述完毕后，用100％的甲醇或乙腈1ml/min的流量再次冲洗整个系统，时间30分钟以上，这是为了冲洗干净色谱柱内的样品残留物，因为有些化学组分在流动相的配比（有机溶剂浓度低）情况下，没有被洗脱出色谱柱，这样久而久之会逐步降低柱效。
4．如果流动相中没有使用缓冲液，在此情况下直接执行上述第3步即可，但时间约为60分钟。
5．在执行上述冲洗时，用10ml的注射管配合进样阀附件中的一个冲洗头，用纯水，按照进样阀说明书的指导冲洗进样阀，LOAD和INJECT两个位置都要清洗。
每次使用仪器后都按照上述步骤进行维护，可大大降低仪器的故障率，同时
也可以减少第二天使用仪器时的平衡稳定时间。

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