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平板细胞克隆形成试验
省部重点实验室
2012/06/15
私聊
生命科学仪器综合讨论
概念:
细胞克隆形成率即细胞接种存活率,表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆,而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
基本步骤:
1、取对数生长期的各组细胞,分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。
2、将细胞悬液作梯度倍数稀释,每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2~3周。
3、经常观察,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去上清液,用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液,加适量GIMSA应用染色液染10~30分钟,然后用流水缓慢洗去染色液,空气干燥。
4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,用肉眼直接计数克隆,或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。
克隆形成率 =(克隆数/接种细胞数)×100%
平板克隆形成试验方法简单,适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好,不能有细胞团,接种密度不能过大。
分
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版主-zhang8826857
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+关注
私聊
容百川
第1楼
2012/06/16
克隆,这个技术说了很久了,现在看来还有很长的路要走啊
0
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