差示反转录PCR[mRNA差异显示技术]

（2）逆转录及PCR扩增

SuperscriptTMⅡ试剂盒(Cat No:18064-022，Invitrogen公司），GIBCO BRL公司；RNAimage试剂盒，GenHunter公司；Taq DNA聚合酶和dNTPs，华美生物工程公司；寡核苷酸引物，上海生工生物工程公司合成；其它试剂均为国产分析纯产品。

（3）PAGE凝胶检测

100bp DNA ladder(Cat No:MG0911), 华美生物工程公司；丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，BIOMOL公司；其它试剂均为国产分析纯产品。

1.4主要仪器

PTC-100[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp]基因扩增仪（Techne公司，英国），GeneGenius 凝胶成像系统（SYNGENE公司，美国）。-70℃超低温冰箱(Thermo Forma，美国),PCR超净台(基因有限公司，美国),DYY-Ⅲ-5型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂), 5810R低温冷冻离心机(Eppendorf，德国),Micro-MB3616型高速离心机(IEC公司，美国),Vortex GENIE2(基因有限公司，美国),GeneQuant核酸定量仪(Pharmacia Biotech 公司,英国)。CS101-2A电热鼓风干燥箱（银河，中国重庆），DYY-111 12型三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂），DYY-111 20A型DNA序列分析电泳槽（北京六一仪器厂），TY-80A脱色摇床（北京六一仪器厂）。

2 实验方法

2.1　总RNA的提取与检测

（1）用品的准备

塑料器皿，如离心管、Tip头等用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小时以上，高压灭菌并烘干后使用；所用溶液用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小时以上，高压灭菌后4℃保存；玻璃器皿经180℃烘烤12小时以上，冷却备用。

（2）试剂的配置

① CSB缓冲液
42mmol/L柠檬酸钠(Sodum citrate)
0.83%(W/V)十二烷基肌氨酸钠(N-lauryl sarcosine)
0.2mmol/L巯基乙醇(β-mercaptoethanol)(使用前加入)

（3）RNA提取

对悬浮培养细胞A<1>、B<1>进行RNA提取，提取步骤如下：

① 50ml离心管中加入10ml变性匀浆液，冰浴5分钟。
② 取0.5g细胞在液氮中研磨至粉末，转移至预冷的变性匀浆液中，加200ulβ巯基乙醇，振荡混匀。
③迅速加入1ml 2mol/L乙酸钠(PH4.0)，充分混合。
④ 加入10ml水饱和酚，剧烈振荡10~15秒，在冰上放置5分钟。
⑤ 加入2ml氯仿:异戊醇(24:1)，剧烈振荡10~15秒，在冰上放置15分钟。
⑥ 4℃，12,000g，离心20分钟。
⑦ 小心移取上层水相，弃去中间相和下层有机相。
⑧ 加入6ml水饱和酚，剧烈振荡10~15秒，在冰上放置5分钟。
⑨ 加入6ml氯仿:异戊醇(24:1), 剧烈振荡10~15秒，在冰上放置15分钟。