菌种鉴定条件

菌种保管要注意：

　　1.应充分了解每种细菌的不同生物性状及营养要求，以选择适宜的培养基。一般原则是使细菌能够生长而不易变异的前提下，必须选择营养丰富的培养基，一般不用含糖的培养基。液体培养基不适于保存菌种。

　　2.培养后最好在细菌尚未旺盛发育之前取出，医学教`育网搜集整理放冰箱内保存。

　　但应注意，一般细菌大多保存于4℃冰箱中，但真菌，霍乱弧菌、铜绿假单胞菌及粪产碱杆菌需在室温保存。而脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌及初次分离的流感嗜血杆菌需保存于37℃孵箱中。

　　3.保存菌种应做鉴定记录。在主要培养基上生长情况、菌落特征、形态及革兰染色或特殊染色反应、生化反应、血清学性状以及个别菌种需要的动物试验结果等。

　　4.保存的菌种应有两套，一套供保存传代用，一套供实验用。

　　5.定期转种，每转种三代作一次鉴定。

　　6.专人保管和发放，严格保管和发放制度。

1.细菌种属的鉴定

　　DNA碱基组成的测定 G+C mol%含量不同的细菌，为不同种细菌；含量相同的可能为不同种的细菌。细菌的G+C mol%相当稳定，不受培养条件、菌龄和其他外界因素影响。最常用的方法是热变性法。

　　DNA-DNA杂交 DNA杂交可得出DNA之间核苷酸顺序的互补程度，从而推断不同细菌基因组间的同源性。

　　16S rRNA同源性分析 rRNA-DNA杂交、16S rRNA序列测定、16S-23S rRNA序列测定

　　此外限制性内切酶长度多态性分析（RFLP）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、随机引物扩增法（RAPD）等技术常用于菌株间的差异比较。

　　2.细菌种属特异基因

　　某些基因为细菌种特有或属共有，通过对这些基因的检测可以鉴定细菌的种或属。如编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的inv基因：invA、invB、invC、invD、invE等是一组只存在于致病性沙门菌中的独特的保守基因序列。鞭毛蛋白dlh基因通常只存在于伤寒沙门菌；IS6110、IS986插入片段为结核分枝杆菌复合群所拥有等。

　　3.细菌毒力基因

　　可以测定霍乱弧菌的霍乱毒素基因、产肠毒素大肠埃希菌的耐热（ST）和不耐热肠毒素（LT）以及白喉棒状杆菌的外毒素基因以示相应的细菌存在。

细菌鉴定的质量由多种因素组成，所以细菌鉴定的质量控制应包括细菌分离的质量控制、染色液的质量控制、鉴定试剂的质量控制、鉴定设备的质量控制等。

（一）分离培养质量控制

用血琼脂和巧克力培养基接种肺炎链球菌、B-溶血和草绿色溶血的链球菌、流感嗜血杆菌等苛养的标准菌株或经标准化试剂已证实结果正确的菌株进行测试，判断实验室的分离能力。

（二）染色液质量控制

每天在开始用染色液前应检查染色液的质量和检测有无污染。

（三） 鉴定试剂质量控制

购入新的试剂；试剂更换批号；更换生产厂家；结果发生异常等情况时均应选择相应标准菌株进行质量控制。

（四）自动化设备

试剂质控要求同鉴定试剂；设备软件升级、修改版本、或大的维修时均应进行质量控制程序。

获得纯化的微生物分离菌株后，首先判定是原核微生物还是真核微生物，这实际上在分离过程中所使用的方法和选择性培养基已经决定了分离菌株的大类的归属，从平板菌落的特征和液体培养的性状都可加以判定。然后，如是原核微生物，便可根据表 14-3 所示的经典分类鉴定指标进行鉴定，如条件允许，可做碳源利用的 BIOLOG-GN 分析和 16S rDNA 序列分析。多项结果结合起来确定分离菌株的属和种。

表 14-3 微生物经典分类鉴定方法的指标依据

1. 采样
以采集土壤为主。一般在有机质较多的肥沃土壤中，微生物的数量最多，中性偏碱的土壤以细菌和放线菌为主，酸性红土壤及森林土壤中霉菌较多，果园、菜园和野果生长区等富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。采样应充分考虑采样的季节性和时间因素，以温度适中，雨量不多的秋初为好。因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的，如在夏季或冬季土壤中微生物存活数量较少，暴雨后土壤中微生物会显著减少。采样方式是在选好适当地点后，用无菌刮铲、土样采集器等，采集有代表性的样品，如特定的土样类型和土层，叶子碎屑和腐质，根系及根系周围区域，海底水，泥及沉积物，植物表皮及各部，阴沟污水及污泥，反色动物第一胃内含物，发酵食品等。
具体采集土样时，就森林、旱地、草地而言，可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；就水田等浸水土壤而言，一般是在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面5~15cm处的土。将采集到的土样盛入清洁的聚乙烯袋、牛皮袋或玻璃瓶中。采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等。采好的样品应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。如果要分离嗜冷菌，则在室温下保存试样会使嗜冷菌数量明显降低。
在采集植物根际土样时，一般方法是将植物根从土壤中慢慢拔出，浸渍在大量无菌水中约20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分土即为根际土样。
在采集水样时，将水样收集于100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中。由于表层水中含有泥沙，应从较深的静水层中采集水样。方法是：握住采样瓶浸入水中30~50cm处，瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。水样采集完毕时，应迅速从水中取出采集瓶并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶，采集的水样应在24h之内迅速进行检测，或者4℃下贮存。
2. 增殖培养
一般情况下，采来的样品可以直接进行分离，但是如果样品中我们所需要的菌类含量并不很多，而另一些微生物却大量存在。此时，为了容易分离到所需要的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，即设法增加所要菌种的数量，以增加分离的几率。可以通过选择性的配制培养基(如营养成分、添加抑制剂等)，选择一定的培养条件(如培养温度、培养基酸碱度等)来控制。具体方法是根据微生物利用碳源的特点，可选定糖、淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其他微生物就可能死亡或淘汰。对G一菌有选择的培养基(如结晶紫营养培养基、红—紫胆汁琼脂、煌绿胆汁琼脂等)通常含有5%~10%的天然提取物。在分离细菌时，培养基中添加浓度一般为50μg／m1的抗真菌剂(如放线菌酮和制霉素)，可以抑制真菌的生长。在分离放线菌时，通常于培养基中加入1~5m1天然浸出汁(植物、岩石、有机混合腐质等的浸出汁) 作为最初分离的促进因子，由此可以分离出更多不同类型的放线菌类型；放线菌还可以十分有效地利用低浓度的底物和复杂底物(如几丁质)，因此，大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物的琼脂平板上进行的，而不是在含丰富营养的生长培养基上分离的；在放线菌分离琼脂中通常加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖；此外，为了对某些特殊种类的放线菌进行富集和分离，可选择性地添加一些抗生素(如新生霉素)。在分离真菌时，利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数、分离和签定；在分离培养基中加入一定的抗生素如氯霉素、四环素、卡那霉素、青霉素、链霉素等即可有效地抑制细菌生长及其菌落形成；抑制细菌的另外一些方法有：在使用平皿之前，将平皿先干燥3~4天；降低培养基的pH值或在无法降低pH时，加入1：30000玫瑰红。这样有利于下阶段的纯种分离。
3. 培养分离
通过增殖培养，样品中的微生物还是处于混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且要控制得细一点，好一点。同时必须进行纯种分离，常用的分离方法有稀释分离法、划线分离法和组织分离法。稀释分离法的基本方法是将样品进行适当稀释，然后将稀释液涂布于培养基平板上进行培养，待长出独立的单个菌落，进行挑选分离。划线分离法要首先倒培养基平板，然后用接种针(接种环)挑取样品，在平板上划线。划线方法可用分步划线法或一次划线法，无论用哪种方法，基本原则是确保培养出单个菌落。组织分离法主要用于食用菌菌种或某些植物病原菌的分离。分离时，首先用10%漂白粉或0.1%升汞液对植物或器官组织进行表面消毒，用无菌水洗涤数次后，移植到培养皿中的培养基上，于适宜温度培养数天后，可见微生物向组织块周围扩展生长。经菌落特征和细胞特征观察确认后，即可由菌落边缘挑取部分菌种进行移接斜面培养。
对于有些微生物如毛霉、根霉等在分离时，由于其菌丝的蔓延性，极易生长成片，很难挑取单菌落。常在培养基中添加0.1%的去氧胆酸钠或在察氏培养基中添加0.1%的山梨糖及0.01%的蔗糖，利于单菌落的分离。
4. 筛选
经过分离培养，在平板上出现很多单个菌落，通过菌落形态观察，选出所需菌落，然后取菌落的一半进行菌种鉴定，对于符合目的菌特性的菌落，可将之转移到试管斜面纯培养。这种从自然界中分离得到的纯种称为野生型菌株，它只是筛选的第一步，所得菌种是否具有生产上的实用价值，能否作为生产菌株，还必须采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。如果此野生型菌株产量偏低，达不到工业生产的要求，可以留之作为菌种选育的出发菌株。
5. 毒性试验
自然界的一些微生物在一定条件下将产生毒素，为了保证食品的安全性，凡是与食品工业有关的菌种，除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌无须作毒性试验外，其他微生物均需通过两年以上的毒性试验。