微生物的分离纯化及稀释平板菌落计数

二、实验材料
1、活材料：苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）菌剂。
2、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；高氏一号琼脂培养基；加有氯霉素（或庆大霉素）和孟加拉红的马丁氏琼脂培养基:在1000mL培养基中加入注射用氯霉素2mL，孟加拉红33.4mg，均于灭菌前加入。
3、材料：肥沃茶园土。
实验用品
内装15～20个玻璃珠的90mL无菌水、9mL无菌水、直径9cm的无菌平皿、1mL无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲、经2mm土壤筛过筛的菜园、天平、试管架、无菌称量纸、酒精灯、火柴、接种环、无菌水。
三、实验方法
（一）稀释平板测数法
1、样品稀释液的制备
准确称取待测样品10g，放入装有90mL无菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20～30s，即成10－1稀释液；再用1mL无菌吸管，吸取10－1稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10－2稀释液；再换一支无菌吸管，吸取10－2稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，也吹吸3次，即成10－3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9等一系列稀释菌液。
用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10－7、10－8、10－9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10－4、10－5、10－6稀释度，测定放线菌数量时，采用10－3、10－4、10－5稀释度，测定真菌数量时，采用10－2、10－3、10－4稀释度。

2、平板接种培养
平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。
⑴混合平板培养法
将无菌平板编上10－7、10－8、10－9号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取1×10－9稀释液各1mL放入编号10－9的3个平板中，同法吸取10－8稀释液各1mL放入编号1×10－8的3个平板中，再吸取1×10－7稀释液各1mL放入编号1×10－7的3个平板中，由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换。然后在9个平板中分别倒入已熔化并冷却至45～50℃的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷凝后倒置，在30℃下培养。至菌落长出后即可计数。
⑵涂抹平板计数法
涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1mL菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上，每个编号设三个重复。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20～30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至菌落长出后即可计数。

（二）土壤中好气性细菌的分离与计数
1、土壤稀释液的制备
按“稀释平板测数法”的相同步骤进行，按无菌操作法将土壤稀释至10－6即可。
2、分离方法
可以用三种方法进行分离。
⑴混菌法：按“稀释平板测数法”中的“混合平板培养法”进行，使用的稀释度为10－4、10－4、10－6三个，各做3个重复。
⑵涂抹法：按“稀释平板测数法”中的“涂抹平板测数法”进行，使用的稀释度为10－3、10－4、10－5三个，各做3个重复。
以上两法又统称为稀释平板分离法，可同时用于所分离菌的计数。
⑶划线法：用灭菌接种环沾取10-1稀释液1环于已凝固的平板上进行划线（图示）。划线可按以下两种方式进行，一种为交叉划线法，是在平板的一边做第一次“Z”字形划线。转动培养皿70°角，将接种环在火上烧过并冷却后，通过第一次划线部分，做第二次“Z”字形划线。同法进行第三次、第四次划线。另一种为边疆划线法，是从平板边缘的一点开始，连续作紧密的波浪式划线，直至平板中央。转动培养皿180°，再从平板另一边（不烧接种环）同样划线至平板中央。划线法实质上属于一种“由点到线”的稀释法，较适用于含菌比较单一的材料的纯化，对于土壤这类微生物高度混杂的样品则较少使用。
以上各种分离法，都应按无菌操作进行。所用的培养基若在倒平板前，按50μg/m L 的量加入用乙醇溶解的制霉菌素或放线菌酮（起抑制霉菌的作用），效果会更好。
3、培养
将上述接种过土壤悬液的平板倒置，于28～30℃培养，至长出菌落为止（24～36h）。
4、挑菌纯化
在平板上选择分离较好的有代表性的单菌落接种斜面，同时作涂片检查，若发现不纯，应挑取此菌落做进一步划线分离，或制成菌悬液再做稀释分离，直至获得纯培养体。
5、计数
选取混菌法和涂抹法中每皿菌落数30～300的平板，分别按“稀释平板测数法”中的“混合平板测数法”和“涂抹平板测数法”中的公式计数。这样求得的是每克原始土样中的活菌数，若要折算为每克干土的含菌数，还应将此数值除以干土在土样中所占的质量分数(烘干土的质量/原土样的质量)。
注：土壤含水量的测定是将一定质量的土壤在105～110℃下烘干至恒重，再称干重。

（三）、土壤中放线菌的分离与计数
1、土壤稀释液的制备
按实验“稀释平板计数法”中的方法进行，将菜园土稀释至10－5。在稀释时，可在盛无菌水的三角瓶中加10滴100g/L的石炭酸溶液和50μg/m L 的制霉菌素以抑制细菌和霉菌的生长。
2、分离方法
采用稀释平板分离法，又可分为两种方法。
⑴混菌法：按“稀释平板计数法”中的“混合平板培养法”进行，所不同者是稀释度，应采用10－3、10－4、10－5三个稀释度，各做3个重复。
⑵涂抹法：按“稀释平板计数法”中的“涂抹平板计数法”进行，应采用10－2、10－3、10－4三个稀释度，各做3个重复。
3、培养
将上述接种过土壤悬液的平板倒置于28～30℃培养4～5d。
4、挑菌纯化
从平板中选择分离较好的放线菌菌落（应与细菌菌落区别开）较接斜面，并制片作纯度检查，若不纯，应进一步将该菌作稀释平板分离或划线分离，直至获得纯培养。