外源基因在大肠杆菌中的表达

(二) 质粒DNA的小量制备

1、传统方法

（1）用灭菌牙签挑单菌落于3 ml LB培养液中，37℃培养过夜。

（2）在每个EP管中倒入1 ml 左右的过夜培养物，6,000 rpm 离心1分钟以收集菌体。

（3）将菌体重悬于100 μl 4℃预冷的溶液I中，并加入200 μl新配制的溶液II, 盖紧管口，快速颠倒离心管6-7次，然后，冰浴5分钟。

（4）加150 μl 4℃预冷的溶液III, 倒置5-6次以混合内容物，然后，冰浴5分钟。

（5）12,000 rpm 离心10分钟后，小心吸取上清至另一EP管中。

（6）加2倍体积的无水乙醇，振荡混合，并在室温放置5分钟。

（7）12,000 rpm离心5分钟后，移去上清，并用70%乙醇漂洗DNA沉淀。DNA沉淀自然干燥，并溶于20 μl 双蒸水或1×TE缓冲液 (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 中。

2. Promega公司Wizard Plus小量DNA纯化方法-离心方案（适用于产品A1330，A1340，A1460及A1470）

（1）12,000 rpm离心1分钟，以沉淀1-10 ml过夜培养物。

（2）用250μl Cell Resuspension Solution充分悬浮大肠杆菌细胞。

（3）加250μl Cell Lysis Solution，倒置5-6次混合。

（4）加10μl Alkaline Protease Solution，倒置5-6次混合，室温放置5分钟。

（5）加350μl Neutralization Solution，倒置5-6次混合。

（6）室温，最高转速离心10分钟，回收上清。

（7）将离心柱插入收集管中。

（8）将上清倒入离心柱中。

（9）室温，最高转速离心1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。

（10）加750μl Wash Solution（加乙醇），最高转速离心1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。

（11）重复步骤（10）（用250μl Wash Solution）。

（12）室温，最高转速离心2分钟。

（13）将离心柱插入一个无菌的1.5 ml微量离心管中。

（14）在离心柱中加50-100μl Nuclease-Free Water，室温，最高转速离心1分钟。

（15）DNA溶液保存在-20℃备用。

(三) 质粒DNA的中量制备

1. 在100 ml 含100 μg/ml 氨苄青霉素的LB培养液中加入1 ml pET-15b/Novablue甘油菌，37℃培养过夜；

2. 4℃, 4,000 rpm离心10分钟以收集菌体；在菌体用3 ml 溶液 I (50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris, pH 8.0, 10 mmol/L EDTA, pH 8.0) 充分悬浮后，加入6 ml 溶液II (0.2 mol/L NaOH, 1% SDS)，并倒置混合，冰浴5-10分钟；

3. 加入4.5 ml 溶液III（60ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml 冰乙酸和28.5ml水），轻摇混合，冰浴10分钟；

4. 4℃，12,000 rpm 离心20分钟，小心吸取上清至另一个50 ml离心管中；加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10分钟；

5. 室温，10,000 rpm离心10分钟以沉淀DNA；

6. 在沉淀用70%乙醇漂洗，自然干燥，并溶于0.3 ml 的TE (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 缓冲液中，然后转入EP管中；

7. 加入等体积的5 mol/L LiCl, 室温，10,000 rpm离心10分钟以沉淀大分子RNA分子；

8. 回收上清，加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，12,000 rpm 离心5分钟以沉淀DNA；

9. DNA沉淀用70%乙醇漂洗，然后，自然干燥；

10. DNA沉淀溶于200 μl含50-100 μg/ml 胰RNA酶的TE缓冲液中，在37℃保温30分钟；

11. 加入等体积的13% PEG8000/1.6 mol/L NaCl, 室温放置5分钟；12,000 rpm 离心10分钟以沉淀DNA；

12. 小心移去上清，DNA沉淀溶于200 μl TE (pH 8.0) 缓冲液中，并用酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）抽提一次；小心将上层溶液转移到一个干净的EP管中，并加入0.1体积的3mol/L NaAc (pH 5.2)和2倍无水乙醇，混匀，-40℃放置30分钟；

13. 12,000 rpm 离心5分钟以沉淀DNA；DNA沉淀用70%的乙醇漂洗，自然干燥，并溶于100 μl TE 缓冲液中。最后，用1%的琼脂糖凝胶电泳对DNA进行定量和纯度鉴定。

（四）DNA（PCR产物或质粒）的酶切

1. 一般在15-20 μl体积中酶切0.2-1 μg的DNA，可根据实际情况，按比例放大酶切反应的体积和DNA的量。

2. 一般用7-8 u的限制性内切酶酶切1 μg的DNA，酶:DNA的比率应小于25u/μg，以防止star activity。

3. 限制性内切酶一般保存在50%的甘油中，而大于5%的甘油可能会引起star activity或抑制酶切反应。因此，在酶切反应体系中，甘油的浓度一般应小于5%，也就是说，限制性内切酶的体积应小于酶切反应总体积的1/10。

4. 对于双酶切反应，可考虑在同一种缓冲液中进行，一般要求任一一种限制性内切酶的活性不低于其最大活性的50%。

5. 酶切反应的时间一般为2-3小时。如果酶切不完全，可适当延长酶切反应的时间。



（五）从琼脂糖凝胶或PCR反应物中回收DNA （用Promega公司的Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System—适用于产品A9280、A9281及A9282）

1. 从琼脂糖凝胶中切下含DNA的胶条，并放入一洁净的EP管中。按每10 mg胶条加10 μl的Membrane Binding Solution，漩涡震荡，并在50-60℃保温直到胶条完全溶解；对于PCR反应物，可直接加等体积的Membrane Binding Solution混合。

2. 将SV 微柱插入收集管中，并将上述溶液加入SV微柱，室温放置1分钟。

3. 10,000 g离心1分钟，丢弃流穿液，重新将微柱插入收集管中。

4. 加700 μl Membrane Wash Soluton，10,000 g离心1分钟，丢弃流穿液，重新将微柱插入收集管中。

5. 用500 μl Membrane Wash Solution 重复步骤4，10,000 g离心5分钟。

6. 小心将微柱插入一洁净的EP管中。

7. 在微柱中加50 μl Nuclease-Free Water，室温放置1分钟，10,000 g离心1分钟。

8. 丢弃微柱，将DNA储存在4℃或-20℃。