瘦肉精前处理优化之浅见&给力的IKA

sukiliang

2012/12/15

私聊

前处理综合讨论

曾经在http://bbs.instrument.com.cn/shtmL/20121209/4423580/这个帖子详细介绍过我们的实验室的设备，实验室虽小但是设备还是比较齐全的。特别是前处理的设备绝不吝啬，尽量选取最好的设备加上实验室人员的实力，让我们做出的实验结果更加准确。

我们实验室做的瘦肉精包括盐酸克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺，前处理是以农业部1025号公告-18-2008为基础加以优化，做好一个实验众所周知的是，前处理必须严谨，所以必须借助很多小仪器来帮忙。好了废话不多说。开始做实验！

一、先配置一个PH=5.2的0.2mol/L的乙酸铵缓冲液

因为要调酸所以我一般使用去离子水来配置。先把这烧杯里的水煮开。

Ps：我们实验室有电炉和I K A的电热板，电炉的沸腾速度比I K A的快，但是我还是选择I K A的电热板，因为I K A的安全系数比较高。

等水冷却后用量筒量取一千毫升的去离子水，由于实验室的烧杯缺乏，找来了一个1000毫升容量的烧杯称取15.4g的乙酸铵

然后把水倒入烧杯中，满满的一杯看样子很容易溢出，这个磁力搅拌器还没买的时候我是用玻璃棒来加速乙酸铵的溶解，这样搅拌容易溢出，而且在调PH的时候容易搅拌不均匀。

把带磁的那个小东西丢到烧杯里，拧开转速的按钮，烧杯里的水成旋涡式的搅拌起来，乙酸铵固体在快速的溶解。

把PH的探头放进去就可以直接调酸，而且很方便又不会溢出而且酸和溶液能混合更均匀。

二、乙酸铵缓冲液配置完成后，开始称样，2g动物组织的测试样品，然后加入0.2mol/L的乙酸铵8mL。

Ps：虽然制样人员已经把组织打碎，但是为了基质更分散瘦肉精能完全的融入乙酸铵中，我继续用高速分散器再次捣碎。使用高速分散器前我会把刀头卸下来，用清水冲洗看看刀头有没有污垢，毕竟这是公用的说不好有哪个忘记洗的话就污染了样品。

原来刀头还真是挺脏的，所以必须得洗一下！

1.先往离心管里加入4mL乙酸铵缓冲液把离心管放进去再打开高速分散器，切记刀头绝不能顶到离心管底部，这样会损坏刀头。

等离心管里的组织打碎后关闭电源，用4mL的乙酸铵冲洗刀头，尽量把刀头上的组织冲洗到试管里。

打完一个样品以后先用清水洗一下刀头。

因为组织的脂肪比较多，所以我会再用甲醇再洗一下，最后用清水再洗一遍，纸巾搽干！（不过大家最好准备一根牙签，有时候动物组织捣不碎时需要牙签来把它挑出来）

有人会问甲醇脏了怎么办？回收，实验中使用过的试管离心管全都泡在回收的甲醇里泡过的试管会好洗很多！

特别节目：I K A高速分散器VS漩涡振荡器

VS

十五分钟过后：（比较的两个都是猪组织，那怎么分辨哪个是漩涡震荡，哪个是I K A的高速分散器？仔细看看，I K A的组织偏白漩涡震荡的是偏红的）

从这个对比来看漩涡振荡器十五分钟后已经出现分层，而用IKA高速分散器的还没出现分层，看来以后实验就不能偷懒了，为了能让基质更分散，瘦肉精能完全的融入乙酸铵中，还是用I K A高速分散器吧。

三、加入46.5uLβ-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，漩涡均匀。（如果只做盐酸克伦特罗可以不需要酶解，因为盐酸克伦特罗很稳定）

ps：全部避光进行。

四、37℃下避光水浴振荡16h（避光且开了夜间模式拍摄，所以反光厉害）

翌日

五、取出离心管加入10ng/mL的混合内标，漩涡震荡，8000r/min高速离心5分钟，打开离心管盖加入0.1moL/L的高氯酸5mL。低温高速离心4℃、8000r/min高速离心5分钟，将上清液倒入另一离心管内。

Ps：1、加内标是因为如果按照标准那样做，我怎么也做不到70%-120%的回收率，所以选择加内标。

2、标准上写离心后倾出上清液到另一离心管中，个人觉得下一步是加高氯酸然后再离心的，何必倒来倒去，还要多洗一根试管呢？也同样做过实验，回收率证明没多大区别！（= =！别说我懒，毕竟实验室人少工作量大，一人负责几台仪器而且还包括前处理和善后洗试管的工作，所以偷懒一下）

3、高氯酸有沉淀蛋白的作用，如果不加高氯酸沉淀蛋白，过柱的时候很难过，脂肪会把柱子堵死。

还没加高氯酸的离心，还是比较清晰的。

离心完第一次后加入高氯酸会看到明显的絮状沉淀，下面那张图片不知道是什么问题，絮状沉淀看得不太清楚。

六、直接用NaOH溶液调PH=9.5±0.2（尽量不要调过规定范围，调过规定范围再用酸调回来影响回收率），加入12ml的乙酸乙酯。然后震荡20分钟，让有机溶剂能把样品的药物更充分的提取出来。

Ps：1、如果按照标准的话还有一步是要用高氯酸调PH至1.0±0.2，我一般做实验的时候都会将这部省略，因为曾经说过按照标准的方法来做，发现这样调酸很难调，加很多都调不到PH1.0。

（由于当天整个实验室都很多样品，我们IKA的振荡器表演了一出空中飞管，震荡半个小时空中的离心管还是很安全）

开始震荡来一张！十分安全的震荡着，转速还是最快的那一档次！

七、取出离心管准备离心

8000r/min高速离心5分钟----->把上清液转移到试管里----->然后再加入8mL叔丁基甲醚，再次放到振荡器上震荡15分钟，高速离心，合并有机相

题外话1：请问有没有朋友试过，从实验的第一步一直到合并有机相那一步都是用着同一根离心管呢？我曾经试过，后来发现猪肝的颜色很漂亮。（照片拍于早期，由于个人觉得颜色很漂亮所以拍下了）

亲们有做过加标回收么?如果这样做回收率没多大影响的话这里又可以优化一下了！

题外话2:曾经试过为了节约时间把乙酸乙酯和叔丁基甲醚配了混合液准备一次提取，但是最后发现除了克伦特罗的回收率好以外，其他两种药的回收率很低！亲们你们也是这样的吗？

八、50℃氮气吹干

九、用2%甲酸溶液5mL溶解----->过柱

= =！固相聚取紧张，只好把柱子拔下来，把固相聚取让给人家

十、吹干----->5%甲醇水溶液定容1m----->漩涡震荡----->过膜----->上机

准备吹干了

好了，过摸准备上机了！

好了二十六个动物组织的前处理大功告成了，马上上机去！

加标回收：

本方法经过多次的反复操作，再加上加入氘代物的内标，添加浓度分别为2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml，沙丁胺醇的回收率在98.5%-101%之间；莱克多巴胺的回收率在105%-115%之间（这个药比较难做）；克伦特罗的回收率在99.8%--100%之间

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zyl3367898

第1楼2012/12/15

应助达人

很详细，匀浆、调PH、氮吹、过膜，原来做瘦肉精的过程是这样的，里面有的过程与做蔬菜中农药残留有相似处，不过我们用的国产设备，不知IKA的设备贵不贵。

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sukiliang

第2楼2012/12/15

IKA的设备是进口的不便宜！本来我们实验室制样室也是用IKA的搅拌机后来坏了都没再买，有点小贵啊！
zyl3367898(zyl3367898) 发表:很详细，匀浆、调PH、氮吹、过膜，原来做瘦肉精的过程是这样的，里面有的过程与做蔬菜中农药残留有相似处，不过我们用的国产设备，不知IKA的设备贵不贵。