省部重点实验室
第1楼2012/12/24
3. 培养方法
3.1 斜面培养:斜面培养基上划线接种,37℃培养1-2天。
3.2 摇瓶培养:37℃,往复式摇床,冲程89cm,转速120r/m,种子培养24小时,接种量5%,发酵摇瓶培养48小时。
3.3 种子罐培养方法:将成熟摇瓶种无菌状态收集于接种瓶中,用压差法接入500L种子罐。用液氨将pH调至6.8~7.2,并将控制点设定在6.4。中间控制温度37℃罐压0.05 Mpa,转速260rpm,初始风量10 M3/hr。起始溶氧100%,培养过程中溶氧控制不低于15%。一般培养时间在13~15小时。移种条件:产酸0.5~0.7%,残糖1.0~1.5%,OD值0.3~0.4。
3.4 将成熟种子接入10M3发酵罐,初始控制: 温度37±1℃,罐压0.05Mpa ,转速140-240rpm,风量120-540M3/hr,PH6.4~6.5,溶氧控制不低于10%。当还原糖低于4%时,开始流加50%葡萄糖溶液。理论上流加糖度与消耗糖度相当,一般使发酵液糖度在2~4%之间。后期停止流加,使发酵糖度小于0.5%。
4. 分析方法
4.1 苏氨酸含量:纸层析法。
4.2 还原糖:菲林定糖法。
三、结果与讨论
1. 工程菌种的构建
第一步,解除L-苏氨酸生物合成反馈调节,去除支路代谢的传统方法是采用诱变方法,选育营养缺陷型和代谢类似物抗性菌株;
第二步,强化表达苏氨酸操纵子,将大肠杆菌中苏氨酸合成酶基因thrA、thrB和thrC克隆到质粒pET-11a,并在受体大肠杆菌中表达;
第三步,将苏氨酸分泌相关基因rthB、rhtC克隆到质粒prh-T04,并在受体大肠杆菌中表达。如图一所示:
省部重点实验室
第2楼2012/12/24
将苏氨酸分泌相关基因rthB、rhtC克隆到质粒prh-T04,并在受体大肠杆菌中表达。如图一所示:
图1、E. coli (pTH08+prh-T04)/VT418菌种构建示意图
2、pH对发酵的影响
我们通过对发酵pH精密控制,中和剂为氨水,结果如下图所示:
图2、pH对发酵的影响
3、溶氧对发酵的影响
我们选择两批典型的发酵罐批,一批是充分满足溶氧,另一批是不能充分满足溶氧,结果显示:充分满足溶氧的罐批发酵结果明显好于不能充分满足溶氧发酵罐批。说明控制溶氧对苏氨酸发酵是非常重要。
图3、溶氧对发酵的影响曲线
4、典型罐批的发酵结果
4.1 过程曲线
图4、10M3发酵罐典型发酵曲线
4.2发酵液HPLC图谱
图5、10M3发酵罐发酵液HPLC图谱(点击图片可放大)
4.3发酵结果技术参数
10M3发酵罐的发酵结果为:产酸8.5-9.0%;转化率39-41%;周期48-52小时。