微生物接种和菌种保藏注意事项

(三) 沙土管保藏法
1.沙土处理
(1)沙处理：取河沙经40目过筛，去除大颗粒，加10%HCl浸泡(用量以浸没沙面为宜)2～4h(或煮沸30min)，以除去有机杂质，然后倒去盐酸，用清水冲洗至中性，烘干或晒干，备用。
(2)土处理：取非耕作层瘦黄土(不含有机质)，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性，然后烘干，粉碎，用100目过筛，去除粗颗粒后备用。
2.装沙土管 将沙与土按2：1，3：1或4：1(W/W)比例混合均匀装入试管中(10mm×100mm，装置约7cm高，加棉塞，并外包牛皮纸，12l℃湿热灭菌30min，然后烘干。
3.无菌试验 每10支沙土管任抽一支，取少许沙土接入牛肉膏蛋白胨或麦芽汁培养液中，在最适的温度下培养2～4d，确定无菌生长时才可使用。若发现有杂菌，经重新灭菌后，再作无菌试验，直到合格。
4.制备菌液 用5mL无菌吸管分别吸取3mL无菌水至待保藏的菌种斜面上，用接种环轻轻搅动，制成悬液。
5.加样 用1mL吸管吸取上述菌悬液0.1～0.5mL加入沙土管中，用接种环拌匀。加入菌液量以湿润沙土达2/3高度为宜。
6.干燥 将含菌的沙土管放入干燥器中，干燥器内用培养皿盛P2O5作为干燥剂，可再用真空泵连续抽气3～4h，加速干燥。将沙土管轻轻一拍，沙土呈分散状即达到充分干燥。
7.保藏 沙土管可选择下列方法之一来保藏：
(1)保存于干燥器中；
(2)用石蜡封住棉花塞后放入冰箱保存；
(3)将沙土管取出，管口用火焰熔封后放入冰箱保存；
(4)将沙土管装入有CaCl2等干燥剂的大试管中，塞上橡皮塞或木塞，再用蜡封口，放入冰箱中或室温下保存。
8.恢复培养 使用时挑取少量混有孢子的沙土，接种于斜面培养基上，或液体培养基内培养即可，原沙土管仍可继续保藏。
此法适用于保藏能产生芽孢的细菌及形成孢子的霉菌和放线菌，可保存2年左右。但不能用于保藏营养细胞。

(四) 斜面传代保藏法
1.贴标签 取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管斜面的正上方，距试管口2～3cm处。
2.斜面接种 将待保藏的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上，细菌和酵母菌宜采用对数生长期的细胞，而放线菌和丝状真菌宜采用成熟的袍子。
3.培养 细菌37℃恒温培养18～24h，酵母菌于28～30℃培养36～60h，放线菌和丝状真菌置于28℃培养4～7d。
4.保藏 斜面长好后，可直接放入4℃冰箱保藏。为防止棉塞受潮长杂菌，管口棉花应用牛皮纸包扎，或换上无菌胶塞，亦可用熔化的固体石蜡熔封棉塞或胶塞。
保藏时间依微生物种类而不同，酵母菌、霉菌、放线菌及有芽抱的细菌可保存2～6个月，移种一次；而不产芽孢的细菌最好每月移种一次。此法的缺点是容易变异，污染杂菌的机会较多。