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实战指南——免疫共沉淀篇(进阶)
省部重点实验室
2013/01/08
私聊
生命科学仪器综合讨论
1.首先盐浓度至少0.15M或以上。
盐浓度主要指Na盐浓度。有人会问为什么不是钾盐?因为钾盐会更容易跟某些试剂(或离子)形成沉淀,诸如SDS,因此在某些情况下,钾盐会对后续的某些实验带来未知的麻烦,所以一般盐浓度指Na盐。盐浓度过低对某些与染色体结合较牢的蛋白的抽提(非破膜的温和裂解)效率也较差,可能会丢失部分信息;而盐浓度过高又会造成某些相互作用较弱的复合体解体,因此,通常选择0.15——0.3M做细胞裂解。纯化蛋白通常选取0.6M以上进行IP。
小技巧:最初几遍的漂洗buff要和IP时的盐浓度相同。经验上,纯化蛋白时,若用低盐裂解细胞、高盐漂洗去杂质,蛋白丢失较多;所以,一般如前所述。当然,也可以高盐裂解低盐漂洗,但是对除杂质不利。
2.通常IP体系中NP40含量0.2——0.5%。NP40在0.5——1.0%时,染色体很容易析出(很黏,成胶状会裹住beads,同时粘下很多蛋白),用这样的裂解液破碎细胞则可能需要超声。通常由于习惯上避免增加不必要的操作,所以在非必要的情况下,选择前述的浓度区间。
3.可适当添加EDTA,螯合金属离子保护DNA和蛋白。特殊情况下还可选择添加EGTA,螯合Ca2+研究钙相关蛋白。此外,裂解液中甘油浓度一般介于15%-20%之间。
4.很多市售或自制的裂解液过于温和,需要考虑采用机械或者超声等手段提高裂解效率(超声要慎用,可能破坏弱的相互作用)。但是,有些时候裂解液的冻融又可能影响某些弱的相互作用,所以不太建议冻融裂解液——即最好裂解液制备好后立即进行coIP。当然,如果证实冻融无影响可考虑将蛋白样品保存-80度待用,这对实验日程的安排会更平易。
5.裂解产物的蛋白浓度越高越好。前几日回复一贴子,不知道出于什么动因该LZ主动稀释裂解样品的蛋白浓度再IP,所幸不是做coIP。上面提到过表达会制造相互作用的假象,反过来说蛋白浓度过稀,某些相互作用就测不到(不一定是弱的相互作用)。因此,细胞的裂解效率会直接影响实验的结果。通常细胞裂解产物的蛋白浓度可达7-8mg/ml左右,但是更常规的现象是达不到这种浓度;当然不是说低于7-8mg/ml就不能进行coIP,只是需要考虑这一因素。因此,在多数情况下要尽可能避免稀释你的细胞裂解液。
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