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高压气体基因枪的标准操作程序(SOP)
省部重点实验室
2013/05/12
私聊
生命科学仪器综合讨论
关键词:Gj-1000高压气体基因枪
目的:Gj-1000高压气体基因枪的正确使用
酵母基因枪转化
一 钨粉的制备
1. 60mg(w)放在离心管中加入无水乙醇,用超声波粉碎机至手感温度发烫;
2. 1000r/min离心10s,去掉上清液;
3. 加1ml无水乙醇,漩涡振荡3~5分钟;
4. 静止1分钟;
5. 1000r/min离心10s,去掉上清液;
6. 加1ml消毒蒸馏水,旋涡振荡,离心沉淀,弃掉上清液;
7. 重复(6)三次;
8. 在沉淀的金粉或钨粉中加入50%甘油,浓度为60mg(钨粉)/ml。
二 DNA子弹的制作
1. 振荡50%甘油中的钨粉,使之成为悬浮液;
2. 取50μl的悬浮液于离心管中(此管可以打6枪,根据实验样品的多少与分成几个小管);
3. 取一个小管在液体上的壁处用加样器加入5~10μl的质粒DNA(浓度为1μg/μl),振荡30s,再在小管壁上加入20μl亚精胺(0.1M),振荡30s。边振荡便加入50μlCaCl2溶液(2.5M),漩涡振荡30s~1min,之后静置1min,重复(漩涡振荡30s~1min,之后静置1min)5次左右,冰上静止30min,15000r/min离心10s,弃掉上清液;
4. 加入150μl70%的乙醇,吹打一下沉淀,若沉淀均匀散开,则离心(3000r/min 10s),弃掉上清液,加入无水乙醇,进入第(5)步操作。若吹打不散,则用超声波振散,条件为,加70%的乙醇600μl,功率200W,超声波作用1s,4~6次,然后离心,弃掉上清液;
5. 加入250μl无水乙醇,不破坏沉淀,静置1min,离心(1000r/min 10s)弃掉上清液;
6. 加入大于60μl无水乙醇振荡使成为悬浮液,如悬浮良好,可将此悬浮液用加样器取10μl分别滴在钢膜上,共可加样在6片钢膜上。这样平均每片钢膜为:0.5mg钨粉,0.8μgDNA(以5μl质粒DNA计,质粒多一些效果会好一点)。
三 实验前的准备
1. 75%的已醇对枪室,样品圆筒室及气体加速管包括封口螺母进行消毒灭菌;
2. 将可破裂圆膜在100%乙醇中浸泡15min消毒,然后再无菌条件下干燥:钢膜则在121℃高温消毒20min后烘干(也可用75%乙醇消毒);
3. 清洁高压管道,在新装基因枪或重新移动位置时,连接高压气体钢瓶与压力调节阀、表系统的的高压管道的一端接口,另一端先不与基因枪的接口相连,握住此端朝向地面,使钢瓶放气(小流量)冲洗此管1~2s,再连接到基因枪上;
4. 消毒操作工具。
四 操作步骤
1. 打开气体瓶阀,调节压力使发射压力达到试验工作要求的范围;
2. 开动真空泵;
3. 选择所需压力的爆破膜(100MP),将它放在钢膜螺母的内圆孔的台肩上,将钢膜螺母旋在储气仓螺口上,用球形扳手将螺母旋紧 ,确保不漏气;
4. 将涂有DNA微粒的钢膜的放在钢膜架上,等干后用镊子夹起放在弹膜架的圆孔中(带有微粒的一面朝下),旋紧钢膜封口螺母;
5. 用镊子将涂有待转化酵母的YPD平板放入基因枪样品架上,此样品架可在样品室内选择合适的位置(4.5cm);
6. 将已装上DNA的弹膜座装在已装好样品的样品室,安装方法:将手柄往下移并旋转至卡住,这样发射腔筒下平面与升降座上平面之间扩大了空间,可将将样品室与弹膜座放在升降底座上,当手柄放开后,样品室上升,是三件体结合在一起,件与件之间都有密封圈密封;
7. 按下真空开关,真空泵开始工作,真空表指示针指示真空下降,当真空度达到0.085~0095Mpa时,即可按高压触发按钮向储气仓内充气,(若真空抽不上,可能三件体没有合上,可移动一下三件体),同时观察高压气体监测表的的压力值。在达到爆破膜的爆破压力时,瞬间产生一个气体冲击波轰击钢膜,同时钢膜表面的微弹(包覆DNA微粒)通过垫网继续高速飞行射入靶细胞;
8. 关闭真空按钮,按下真空释放钮,使系统卸荷并将样品取出。这样一次基因导入试验完毕;
9. 按下手柄,取出样品室与弹膜座,从样品室的样品皿座上取出样品皿,盖上盖子,编号记录实验内容及条件;
10. 从弹膜座圆孔穴中取出钢膜,接着拧下封口螺母,从圆孔台肩上取出已穿孔的爆破膜;
11. 从步骤3开始重复操作,完成所有的样品处理;
12. 关机:枪用完后应关闭氦气瓶阀,并在真空泵仍处在工作状态,按下高压触发开关是氦气压解除。关闭电源总开关。从插座上拔下电源线插头;
13. 实验完毕后进行整理清洁工作。一般用75%的乙醇清洗[9]。
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