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蒽酮法测定可溶性糖
省部重点实验室
2013/06/14
私聊
生命科学仪器综合讨论
一、原理
糖在浓硫酸作用下,可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛,生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物,在一定范围内,颜色的深浅与糖的含量成正比,故可用于糖的定量测定。
该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物,不但可以测定戊糖与己糖,而且可以测所有寡糖类和多糖,共中包括淀粉、纤维素等(因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应),所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量,实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量,在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下,用蒽酮法可以一次测出总量,省去许多麻烦,因此,有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时,因与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外,不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同,果糖显色最深,葡萄糖次之,半乳糖、甘露糖较浅,五碳糖显色更浅,故测定糖的混合物时,常因不同糖类的比例不同造成误差,但测定单一糖类时,则可避免此种误差。
糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为630nM,故在此波长下进行比色。
二、仪器与用具
电子天平;容量瓶:100ml 4个,50ml 2个;漏斗;小试管若干支;电炉;刻度吸管0.5ml1支,2.0ml 3支,5ml 4支;分光光度计;记号笔。
三、试剂
蒽酮乙酸乙酯试剂:取分析纯蒽酮1g,溶于50ml乙酸乙酯中,贮于棕色瓶中,在黑暗中可保存数周,如有结晶析出,可微热溶解;浓硫酸(相对密度1.84)。
四、方法
1. 标准曲线的制作按方法一标准曲线的制作方法加入标准的蔗糖溶液,然后按顺序向试管中加入0.5Ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5Ml浓硫酸,充分振荡,立即将试管放入沸水浴中,逐管准确保温1Min,取出后自然冷却至室温,以空白作对照,在630nM波长下测其光密度,以光密度为纵坐标,以糖含量为横坐标,绘制标准曲线,并求出标准线性方程。
2.可溶性糖的提取取新鲜植物叶片,擦净表面污物,剪碎混匀,称取0.10~0.30g,共3份,分别放入3支刻度试管中,加入5~10ml蒸馏水,塑料薄膜封口,于沸水中提取30min(提取2次),提取液过滤入25ml容量瓶中,反复冲洗试管及残渣,定容至刻度。
3. 显色测定吸取样品提取液0.5ml于20ml刻度试管中(重复2次),加蒸馏水1.5ml,以下步骤与标准曲线测定相同,测定样品的光密度。
4. 计算可溶性糖的含量,由标准线性方程求出糖的量,按式(1-1)计算测试样品中糖含量。
可溶性糖含量(%)=(C×V / A×n) / (W×10
6
) (1-1)
式中C:标准方程求得糖量(μg);A:吸取样品液体积(Ml);
V:提取液量(ml);n:稀释倍数;
W:组织重量(g)。
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